鎖陽對運動性腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟炎癥因子的影響

孫曉琴，邱東海，周海濤，譚貢霞，劉江波，張 靜

（1.贛南醫(yī)學院，江西 贛州 341000；2.北京聯(lián)合大學，北京 100023）

中醫(yī)認為，過度的運動訓練可導致元氣耗損，元氣的損耗是機體出現(xiàn)力竭的主要原因。同時，長時間、大強度訓練產(chǎn)生的疲勞，初期傷脾，受訓練時間、運動強度、恢復時間等因素的影響，久之則會傷腎。腎藏精，精化氣，腎氣作為生氣之源，是生命力活動的原動力。研究表明，劇烈運動狀態(tài)下，機體內(nèi)正常的血流分布受運動應激影響被打破，相關器官中的血流量發(fā)生了重新的分布，在肌肉等運動器官中聚集了大量的血液，內(nèi)臟尤其是腎臟中的血流量，伴隨著運動時間的持續(xù)進行和運動強度的不斷增加出現(xiàn)大幅下降，進而引發(fā)“運動性腎缺血”。而當運動完全停止后，大量的血液重新回流到腎臟，運動及恢復期腎血流量則引發(fā)了腎臟的進一步損傷。腎臟對缺血及缺血再灌注損傷表現(xiàn)的異常敏感，2個時相腎血流量的改變在運動性腎缺血再灌注損傷的整個過程中發(fā)揮著重要的作用 。腫瘤壞死因子-α（Tumour necrosis factor-α，TNF-α）等一系列炎癥細胞因子在運動性腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用。 中藥對過度訓練引發(fā)的運動性臟器損傷的保護作用已引發(fā)了全球運動醫(yī)學及運動營養(yǎng)領域?qū)＜?、學者的高度重視。已有研究表明，鎖陽具有抗應激，抗疲勞、抗氧化、清除自由基、提高過氧化物歧化酶活性、降低脂質(zhì)過氧化物的藥理作用。故本實驗選用鎖陽對過度訓練大鼠進行營養(yǎng)干預，觀察其是否可以對過度訓練誘導的腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18蛋白表達發(fā)生影響，從而減輕了腎臟的組織病理學改變，延緩或避免對腎臟的損害。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7周齡72只清潔級雄性Wistar大鼠。

1.2 實驗用藥

鎖陽，產(chǎn)地甘肅，購自北京同仁堂藥店，批號：160925351。

1.3 動物分組與訓練及測試方案

72只大鼠以數(shù)字隨機分組法分為安靜對照組（C組，12只）、一般訓練組（M組，12只）、過度訓練組（OM組，24只）和鎖陽干預+過度訓練組（CM組，24只）。CM組每天灌胃1次，劑量為4.5 g.kg-1（預實驗得出最佳劑量），體積為5 mL.kg-1，其他組等量的生理鹽水。C組大鼠以常規(guī)方式進行飼養(yǎng)，不進行任何運動和營養(yǎng)干預。M組大鼠以中等強度進行為期6周的游泳訓練（無負重），每周訓練6天，每天訓練1次。訓練時間由20min遞增至120min。CM組和OM組則進行6周的遞增負荷力竭游泳訓練，每次訓練均至力竭。負重量由1%逐漸遞增，至第6周負重量遞增至5%的體重，1天2訓（上、下午各1次）。力竭標準以大鼠下沉后10 s仍無法露出水面為準。C、M組大鼠未出現(xiàn)意外性死亡；CM組和OM組大鼠在訓練過程中受多種因素影響，部分大鼠出現(xiàn)意外死亡。訓練結束時，CM組僅剩余12只大鼠，OM組僅剩余10只大鼠。

1.4 指標測定

末次游泳訓練24h后，各組大鼠以乙醚進行適度麻醉后，自頸總動脈取血5mL，37 ℃自然凝固，待血清出現(xiàn)后，放入冰箱24h后，4℃下3 000 r.min-1離心10 min后取上清液，置于-20℃冰箱中保存。剖腹后迅速取雙腎，剔除筋膜，置于預冷的生理鹽水中洗凈血污后，觀察腎臟大小、色澤、質(zhì)地，切取腎組織，以經(jīng)過消毒的鋁箔包好，投入液氮暫存，隨后凍存于-70℃冰箱待測 。

根據(jù)試劑盒說明采用測定相關指標：血清肌酐（Jaffe苦味酸法），血清尿素氮（二乙酰-肟法），腎組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18蛋白表達（免疫組織化學法）。相關試劑盒購自北京利德鴻奧科技有限公司。

1.5 腎臟病理變化、免疫組化結果半定量積分評價

參照Pallers標準及染色程度和范圍（著色范圍參照Riera等標準 ）分別進行腎臟病理變化和免疫組化結果半定量積分評價。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件對相關數(shù)據(jù)進行分析、處理，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（）表示，組間差異采用方差分析，等級計數(shù)資料采用秩和檢驗分析。以P＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為非常顯著性水平。

圖1 4組大鼠腎組織病理（HE，×400）

2 結 果

2.1 不同組別大鼠腎組織的病理學改變

從圖1可知，光鏡下C組、M組大鼠腎組織形態(tài)均沒有出現(xiàn)異常，腎小球和腎小管未發(fā)生淤血、變性和水腫，腎小管管腔中未發(fā)現(xiàn)管型。OM組大鼠腎小球出現(xiàn)明顯的淤血現(xiàn)象，小管上皮細胞出現(xiàn)水腫、空泡變性及管腔擴張，管腔中有少量脫落的絨毛和上皮細胞及各種管型。CM組組織病理學改變較OM組存在明顯的改善。大鼠腎小球出現(xiàn)輕微的小管上皮細胞水腫、空泡變性，管腔擴張現(xiàn)象，無蛋白管型和細胞管型。腎小管Pallers評分，C組、M組組間無顯著差異（P＞0.05），OM明顯高于C組（P＜0.01），CM組顯著低于OM（P＜0.05）（表1），且均未見腎小球2.2不同組別大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較

表1 不同組別大鼠腎小管損害評分比較

表2 不同組別大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較

表3 不同組別大鼠腎組織IL-1β蛋白表達水平比較

表4 不同組別大鼠腎組織IL-6蛋白表達水平比較

表5 不同組別大鼠腎組織TNF-α蛋白表達水平比較

表6 不同組別大鼠腎組織IL-18蛋白表達水平比較

2.2 不同組別大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較

從表2可知，C、M組間血清尿素氮和肌酐水平無顯著性差異（P=0.103，P=0.118，P＞0.05）；OM組顯著高于C組（P=0.006，P=0.003，P＜ 0.01）；CM組顯著低于 OM 組（P=0.031，P=0.028，P＜0.05）。

2.3 不同組別大鼠腎組織相關炎癥因子蛋白表達水平比較

從表3～表6可知，C、M組大鼠腎臟組織IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α蛋白僅有輕度表達，且組間不存在顯著性差異（P＞0.05）；OM組與C組間存在差異（P＜0.01或P＜0.05）；CM組較OM組有所緩解（P＜0.05）。

3 討 論

近年來有研究表明：腎臟組織炎癥因子的表達水平有效地反映運動性腎缺血再灌注損傷程度 。本實驗采用6周的遞增負荷力竭游泳訓練的訓練方式，運動性腎缺血再灌注損傷動物模型造模成功。大鼠腎臟組織相關炎癥因子的蛋白表達上調(diào)，引發(fā)了腎臟的炎性作用的大幅度增強，極大地損傷了腎臟功能，同時也引發(fā)了腎臟組織出現(xiàn)顯著的病理學改變；而采用適宜運動訓練方式的大鼠腎臟組織相關指標未發(fā)生顯著性改變，說明適度的運動訓練不會破壞腎臟組織中促炎因子與抑炎因子間的動態(tài)平衡引發(fā)炎性作用，對腎功能不會造成損傷，組織結構未發(fā)生病理學改變。鎖陽干預組大鼠腎臟組織相關炎癥指標、腎臟功能指標較過度訓練組有明顯改善，表明采用鎖陽對大鼠進行營養(yǎng)干預，可以有效地抑制運動性腎臟缺血再灌注損傷中相關炎性因子的過度表達，確保了正常的腎臟功能組織結構。其機制可能為：鎖陽通過有效地提高機體內(nèi)多種抗氧化酶的活性，清除大強度運動產(chǎn)生的過量的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生與發(fā)展及炎性細胞因子的過度生成與表達，確保了腎臟組織細胞膜的完整性、穩(wěn)定性和通透性，減輕對腎臟功能和組織結構的損傷及機體的免疫機能。其機制可能為：（1）鎖陽富含的黃酮類、三萜類、多糖等多種活性物質(zhì)具有較高的抗氧化活性，可以提高超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，降低脂質(zhì)過氧化物的濃度，清除體內(nèi)過量自由基 ；（2）鎖陽中含有的維生素E可以有效地減輕脂質(zhì)過氧化反應，清除自由基。（3）鎖陽中含有的乙酸等酸性物質(zhì)較油脂更容易失去H.，可以有效地推遲和緩解脂質(zhì)的氧化，終止油脂氧化鏈式反應的傳播，起到揮抗氧化劑的作用。

4 結 論

鎖陽通過抑制炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18表達，明顯地減輕運動性腎缺血再灌注引起的腎功能障礙和腎臟組織病理學改變。

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