成年大鼠丘腦底核離體腦片的制備方法

孫唐娜 王文挺 朱俊玲 李柱一

離體腦片技術與膜片鉗技術分別創(chuàng)建于20世紀60年代與70年代，而將這兩種技術成熟地結合運用，是由Edwards及Blanton兩個實驗組于1989年首先報道。與急性分離或培養(yǎng)的神經(jīng)元相比，離體腦片的神經(jīng)元保持了神經(jīng)細胞之間突觸聯(lián)系及膠質細胞對神經(jīng)細胞的支持和聯(lián)系，因此生理功能也更接近整體狀態(tài)[1]。與整體記錄相比，離體腦片避免了血-腦屏障的影響，各種試劑、藥物等可直接通過灌流液進入腦片作用于神經(jīng)元與膠質細胞，適合藥理學的研究；其次，離體腦片的機械穩(wěn)定性高，因此能獲得高質量長時間的記錄。

丘腦底核(STN)在神經(jīng)解剖學上位于未定帶腹側與大腦腳之間，主要接受來自皮層、丘腦束旁核及蒼白球外側部等的纖維投射，其投射神經(jīng)元為興奮性的谷氨酸能神經(jīng)元，纖維投射到蒼白球內側部或黑質網(wǎng)狀部，通過調控這些中繼核團后最終作用于皮層，因其纖維聯(lián)系廣泛，在運動調節(jié)過程中起著關鍵作用。被科學家稱之為基底節(jié)活動的動力源泉[2]。STN在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病比如帕金森病(Parkinson disease，PD)的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。經(jīng)典理論認為PD條件下，紋狀體系統(tǒng)γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元的過度興奮，導致蒼白球外側部投射到STN的GABA能神經(jīng)纖維對STN的抑制作用減弱，基底節(jié)向皮層的輸出增加[3]。采用離體腦片對STN電生理特性進行研究有助于對STN功能的認識，但既往研究多采用幼齡大鼠進行離體腦片制作[4]，并不適用于PD等退行性疾病的研究。該研究采用氯化膽堿替換氯化鈉配制的低溫切片液切片，取腦時間嚴格把控在30 s之內，孵育液中添加抗壞血酸等抗氧化劑等方法，有效保證了成年大鼠STN的活性，并對其電生理特性進行了初步的記錄和分析。

1 材料和方法

1.1材料成年健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重280～450 g左右，雌雄不限，由空軍軍醫(yī)大學(原第四軍醫(yī)大學)實驗動物中心提供。實驗動物飼養(yǎng)符合國家醫(yī)學實驗動物管理標準，所有實驗獲空軍軍醫(yī)大學(原第四軍醫(yī)大學)醫(yī)學倫理委員會批準，并遵循實驗動物保護、倫理規(guī)范。

1.2主要試劑及儀器(1)切片液成分(單位：mmol/L)包括：氯化膽堿115.00、氯化鉀2.50、磷酸二氫鈉1.25、氯化鈣0.50、氯化鎂8.00、碳酸氫鈉26.00、葡萄糖10.00、抗壞血酸0.10、丙酮酸鈉0.40，滲透壓300～305 mOsm/L，用鹽酸(1 mol/L)將pH調至7.35～7.45。(2)人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L)：氯化鈉 119.0、氯化鉀2.3、磷酸二氫鈉1.0、氯化鎂1.3、氯化鈣 2.5、碳酸氫鈉 26.2、葡萄糖 11.0、抗壞血酸 0.1、丙酮酸鈉 0.4，滲透壓300～305 mOsm/L，用鹽酸(1 mol/L)將pH調至7.35～7.45。(3)電極內液成分(單位：mmol/L)包括：葡萄糖酸鉀128.0、羥乙基哌嗪乙磺酸10.0、磷酸肌酸鈉10.0、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸1.1、三磷酸腺苷鎂鹽5.0、三磷酸鳥苷鈉鹽0.4，用氫氧化鉀將pH值調至7.4，用蔗糖將滲透壓調至300 mOsm/L，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后分裝，-20℃保存。以上藥品均購自Sigma公司。(4)其他試劑和儀器包括：95%O2-5%CO2混合氣(來自第四軍醫(yī)大學教保處)，振動切片機(VT1200S，Leica，Germany)，水平程控電極拉制儀(P-97，Sutter Instruments，USA)，膜片鉗放大器(axon 200A amplifier，Molecilar Devices，USA)，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Digidata 1322A，Molecular Devices)和Clampex 9.0軟件(Molecular Devices)，電動顯微三維操縱器(MX7600，SD，USA)，紅外微分干涉相差顯微鏡(BX51-WI，Olympus，Japan)。

1.3方法

1.3.1STN腦片制備：1%(質量濃度)戊巴比妥鈉按體重40 mg/kg麻醉大鼠，剪開胸腔，暴露心臟，將鈍頭灌流針自左心室插入主動脈固定，灌注60 mL預冷(4℃)并經(jīng)95%O2-5%CO2混合氣飽和的切片液，推送液體速度約3 mL/s，以保證足夠的心輸出量。迅速斷頭取腦，取腦過程輕柔迅速，避免擠壓腦組織，取腦過程控制在30 s之間。腦組織在預冷和95%O2-5%CO2混合氣飽和的切片液中冷卻1～2 min，經(jīng)修塊用振動切片機切取含STN 300 μm厚的冠狀腦片。獲得的腦片置于95%O2-5%CO2混合氣飽和的切片液中32℃孵育30 min，之后再將腦片置于充分含有95%O2-5%CO2混合氣的ACSF中室溫(25℃)至少孵育60 min。

1.3.2STN全細胞膜片鉗記錄：將腦片移入記錄浴槽中，并用鉑金蓋網(wǎng)壓住腦片，注意蓋網(wǎng)絲避開STN。在紅外微分干涉相差顯微鏡(IR-DIC)低倍鏡下確定STN位置，再切換高倍鏡，選擇健康的STN進行全細胞膜片鉗記錄。記錄時首先使細胞處于-60 mV鉗制電壓恢復約5 min，然后切換到電流鉗模式記錄細胞的電壓反應，選擇串聯(lián)電阻在10～20 MΩ，動作電位具有超射的神經(jīng)元用于離線分析細胞膜電位、動作電位等電生理指標[5-6]。數(shù)據(jù)經(jīng)膜片鉗放大器放大，用Digidata 1322A數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和Clampex 9.0軟件采集、存儲，數(shù)據(jù)采樣率為20 kHz，低頻濾波為5 kHz。用Clampfit9.0進行數(shù)據(jù)分析，Origin7.5軟件進行統(tǒng)計處理和作圖。

1.3.3碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色：制備好的STN腦片置于充分含有95%O2-5%CO2混合氣的ACSF中孵育1 h后，移至含5 μg/mL PI的飽和95%O2-5%CO2混合氣的ACSF中繼續(xù)孵育15 min，進行染色。隨后用ACSF清洗3次，每次10 min，染色及清洗過程皆避光進行。在IR-DIC下觀察腦片。

2 結果

2.1成年STN中存活神經(jīng)元的形態(tài)特點將腦片轉移到浸沒式記錄槽中，4倍物鏡下根據(jù)大腦腳的位置判定STN的位置(圖1A)，可見STN呈凸透鏡形，位于未定帶腹側與大腦腳之間，較大腦腳稍透亮(圖1B、C)。40倍鏡下再次確認STN定位并觀察細胞形態(tài)，可見神經(jīng)元胞體、軸突清晰可見，表面光滑、飽滿、有立體感形態(tài)符合STN神經(jīng)元特征(圖1D)。

2.2成年STN腦片神經(jīng)元存活狀況IR-DIC低倍鏡所見STN區(qū)域見圖2A。低倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在STN區(qū)域可見紅色熒光陽性顆粒染色(圖2B)，高倍鏡下可見存活的STN神經(jīng)元，STN存活神經(jīng)元形態(tài)飽滿，輪廓清晰，有立體感(圖2D)，與PI染色紅色熒光標記不共存(圖2E、F)。具體結果見圖2。

2.3STN神經(jīng)元電生理特征STN神經(jīng)元電生理主要特征有超極化刺激起始段的電壓驟降“Sag”、刺激末伴隨反跳去極化產(chǎn)生的動作電位及動作電位后的平臺電位(圖3A)。記錄30個STN神經(jīng)元的“輸入電流刺激-輸出放電個數(shù)”曲線結果見圖3B。將鉗制電流設置在-200 pA，以20 pA的步階脈沖至380 pA，提示基強度為40 pA，放電數(shù)隨電流刺激而增加，刺激強度為40 pA、380 pA時，其放電個數(shù)分別為(4.17±0.72)個和(44.32±6.09)個(圖3B)。超極化產(chǎn)生的“Sag”幅度見圖3C，可見“Sag”幅度隨電壓超極化程度增加而增大(圖3D，n=13)。在全細胞電壓鉗模式下，給予一系列超極化步階電壓刺激，記錄引起“Sag”的離子電流——超極化激活的陽離子流(Ih)，表現(xiàn)為一緩慢激活的內向電流(圖3E)，I-V曲線提示電壓越超極化Ih幅度越大(圖3F)。表1為記錄到的STN神經(jīng)元被動和主動膜特性。

ZID：未定帶，背側部；ZIV：未定帶，腹側部；cp：大腦腳；STN：丘腦底核；A：SD大鼠腦圖譜中STN定位及附近解剖學標志(×4)；B：低倍鏡下STN的定位(圖中不同區(qū)域范圍用虛線進行標識)；C：低倍鏡下STN的紀錄區(qū)域的圖像(圖中不同區(qū)域范圍用虛線進行標識)；D：IR-DIC模式下典型的STN神經(jīng)元 圖 1 IR-DIC下觀察SD大鼠腦片STN及其神經(jīng)元特征

A：低倍鏡IR-DIC下STN的紀錄區(qū)域；B：低倍鏡紅色熒光通道下顯示STN PI染色結果；C：圖A和B的疊加圖像；D：高倍鏡IR-DIC模式下典型的健康STN神經(jīng)元(箭頭所示)；E：高倍鏡紅色熒光通道下的圖像；F：圖D和E的疊加圖像 圖 2 SD大鼠腦片STN神經(jīng)元活性檢測

A：給予40 pA電流刺激后STN被誘發(fā)出動作電位(圖中實線單向箭頭示“Sag”、雙向箭頭示“Sag”測量范圍、虛線單向箭頭示動作電位的反跳去極化)；B：不同大小電流刺激，STN被誘發(fā)出的動作電位個數(shù)；C：細胞超極化產(chǎn)生的“Sag”(實線單向箭頭示“Sag”、雙向箭頭示“Sag”測量范圍)；D：不同大小電流刺激情況下“Sag”的幅度變化；E：一系列超極化電壓刺激產(chǎn)生的Ih電流；F：Ih電流的I-V曲線 圖 3 全細胞膜鉗技術檢查SD大鼠離體STN神經(jīng)元電生理結果

指標n數(shù)值膜電位(mV)67-46.40±1.26 膜電阻(MΩ)38493.10±62.29自發(fā)放電神經(jīng)元發(fā)生率〔n(%)〕6428(43.8)動作電位閾值(mV)30-28.30±1.20 動作電位幅度(mV)3068.00±2.27動作電位半寬(ms)300.80±0.06基強度(pA)3042.00±6.09Ih(pA)38-145.90±12.91

3 討論

本研究通過采用氯化膽堿切片液、主動脈灌流、切片液和ACSF中添加抗氧化劑、控制取腦時間和手法等措施，成功獲得健康的成年大鼠STN離體腦片，并對成年STN神經(jīng)元進行了初步的電生理特性分析，為離體情況研究諸如PD等神經(jīng)退行性疾病STN神經(jīng)元興奮性以及突觸功能等提供了方法。

STN是基底神經(jīng)節(jié)(basal ganglion，BG)內重要的核團，參與了生理情況BG-皮層環(huán)路振蕩的形成[7]。PD情況下BG-皮層原有頻率振蕩節(jié)律增強，異常頻率活動的出現(xiàn)均與STN有關[8]。然而，STN緊鄰皮質腦干束、皮質脊髓束和皮質腦橋束等下行傳導束組成的大腦腳，同時接收皮層、丘腦束旁核及蒼白球外側部等的纖維在STN內部交織，制作腦片時刀片切割這些方向的纖維可能牽拉STN神經(jīng)元。另外，STN作為BG-皮層環(huán)路的重要振蕩控制核團，其神經(jīng)元常有自發(fā)放電[9]。這些因素導致STN神經(jīng)元在切片過程中更容易受損和死亡，使得制作成年STN離體腦片異常困難。因此既往離體STN研究多用20 d以下的幼齡大鼠[4， 10-11]。但是，STN是PD等神經(jīng)退行性疾病重要的靶點，采用幼齡大鼠獲得的結果對PD的研究幫助有限。與既往研究方法相比，本研究采用氯化膽堿替換ACSF中的氯化鈉，膽堿作為一價陽離子取代鈉離子，可減少切片對腦組織損傷引起的神經(jīng)元去極化(無鈉離子進入細胞)進而導致的興奮性毒作用。以往亦有研究者采用蔗糖替換氯化鈉進行切片的方法[12]，但多用于小鼠及幼齡大鼠的腦片制作。作者研究團隊曾嘗試用蔗糖切片液切取成年STN腦片，但效果不佳(未公開發(fā)表)。本研究采用的氯化膽堿僅僅是替換鈉離子，仍然保留了胞外的高氯離子濃度。氯離子是GABA受體的離子流，因此，氯化膽堿可在切片過程中維持一定程度的抑制性突觸發(fā)放，使神經(jīng)元處于超級化狀態(tài)，也有助于神經(jīng)元活性的維持。因此，采用氯化膽堿替換氯化鈉配成的切片液是本方法的關鍵之一。

由于成年大鼠對缺氧耐受力差，同時顱骨較硬，取腦所花時間較幼齡大鼠時間長。本研究先用預冷和95%O2-5%CO2混合氣飽和的切片液給予大鼠主動脈灌流，然后再斷頭取腦。這樣可以降低大鼠腦組織溫度，從而減少腦組織耗氧量。另外，采用主動脈灌流而非左心室灌流，可確保切片液進入體循環(huán)。而心室灌流有時會存在誤插入右心室進入肺循環(huán)的可能。為進一步提高成年STN腦片的活性，本方法將取腦時間控制在30 s以內。在切片液和ACSF中加入抗壞血酸、丙酮酸鈉，有助于保護細胞膜免受脂質過氧化、改善切片過程中的腦缺血，提高細胞存活[13]。此外，通過提高切片液中鎂離子濃度、降低鈣離子濃度，可以降低切片損傷導致N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體激活引起的興奮毒作用。綜合以上措施，本研究可在體重高達450 g的大鼠獲得健康的STN離體腦片。

綜上所述，本文研究采用如下主要步驟成功制備了健康成年大鼠STN離體腦片：(1)切片液采用氯化膽堿替換氯化鈉，稍高滲，切片液和ACSF中加入抗壞血酸及丙酮酸鈉；(2)將灌流針插入主動脈灌注切片液，保證切片液充分置換腦組織細胞外液；(3)取腦應快速，動作迅速輕柔，避免牽拉和擠壓，整個過程持續(xù)通95%O2-5%CO2混合氣。以上措施能提高STN腦片的活性，這種腦片制備方法將有助于對成年大鼠STN神經(jīng)元興奮性及突觸功能的研究，對包括PD在內的神經(jīng)退行性疾病的大鼠模型研究提供幫助。

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