多發(fā)性硬化患者外周血T淋巴細胞受體β鏈可變區(qū)多態(tài)性研究

吳巖 張紀紅 董會卿 萬歲桂 孫雪靜 蘇圣堯

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，目前研究認為其是一種自身免疫性疾病，免疫系統(tǒng)尤其是T淋巴細胞(包括CD4+T細胞與CD8+T細胞)在致病中具有重要作用。T細胞直接或者通過分子模擬機制對髓鞘自身抗原[1]發(fā)生反應而致病。有研究結果顯示，由于中樞性或周圍性免疫調節(jié)異常，導致髓鞘特異性T細胞數(shù)目擴增至致病程度[2]，MS患者髓鞘特異性T細胞處于激活狀態(tài)并具有記憶表型，而健康者髓鞘特異性T細胞處于休眠狀態(tài)的原始表型[3]，處于激活狀態(tài)的髓鞘反應T淋巴細胞表面的黏附分子增多，更易與血-腦脊液屏障發(fā)生反應而進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進而導致炎性脫髓鞘。T細胞受體由αβ或γδ兩條肽鏈構成，前者占成熟T細胞的90%～95%，T細胞的活動均通過T細胞受體而實現(xiàn)，通過監(jiān)測T淋巴細胞可變區(qū)β鏈(T cell receptor β chain variable region，TCRVβ)可了解T細胞免疫功能，以探討MS的發(fā)病機制。

1 對象和方法

1.1觀察對象(1)病例組：收集2012-08-20—2014-03-20首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)內科住院的患者80例，其中臨床孤立綜合征(clinically isolated syndrome，CIS)30例、復發(fā)-緩解型MS(relapsing-remitting MS，RRMS)40例、繼發(fā)-進展型MS患者(secondary-progressive MS，SPMS)10例。CIS組男性16例、女性14例，年齡11～66歲，平均(37.4±16.3)歲；RRMS組男性16例、女性24例，年齡11～70歲，平均(34.6±13.7)歲；SPMS組男性4例、女性6例，年齡30～67歲，平均(40.1±10.9)歲。納入標準：(1)患者符合McDonald 2010 MS診斷標準；(2)復發(fā)期；(3)入院前6周內未使用糖皮質激素及入院前3個月未使用免疫抑制劑；(4)無急性、慢性感染性疾病(血常規(guī)、紅細胞沉降率檢查結果正常)；(5)無惡性腫瘤性疾?。?6)無其他自身免疫性疾病。

(2)對照組：來自同期首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院體檢中心的健康體檢者30名，其中男15名、女15名，年齡20～40歲，平均(31.23±5.98)歲。納入標準：(1)年齡20～40歲；(2)體檢結果(血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)、生化全項及胸X片檢查)正常；(3)采血前1個月內無感冒或流感病史；(4)無感染性疾??；(5)無惡性腫瘤性疾病；(6)無自身免疫性疾病。入組人員均被告知研究目的、內容及參與研究可能帶來的風險，并簽署知情同意書。各組之間性別構成及年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

1.2試劑和儀器TCRVβ單克隆抗體試劑盒、CD3 PERCP、CD8 APC、紅細胞裂解液均為美國BD公司產(chǎn)品，主要儀器包括離心機、四色雙激光流式細胞儀、移液器等。

1.3方法

1.3.1外周血TCRVβ流式細胞術檢測：治療開始前采集空腹外周血2 mL，EDTA抗凝，立即進行檢測。取試管1支，加入20 μL CD3-percp、5 μL CD8-APC、5 μL TCRVβ(A-H)，隨后加入充分混勻的100 μL抗凝血，搖勻后室溫避光20 min；加入2 mL紅細胞裂解液，搖勻，室溫避光10 min，以2600g離心5 min，去上清，堿性磷酸液洗兩次，加入1 mL 1%(質量濃度)多聚甲醛，搖勻；流式細胞儀上機操作(測定前校正儀器)，發(fā)射激光采用氬離子激光器，功率15 mW，激光波長488 nm。用CellQuest多功能數(shù)據(jù)獲取軟件得到相關數(shù)據(jù)。

1.3.2結果判斷：一般指標包括：外周血淋巴細胞比例、T淋巴細胞比例、CD4+T細胞比例、CD8+T細胞比例及CD4+T細胞/CD8+T細胞比例。目前TCRVβ單克隆抗體試劑盒可檢測24個Vβ亞家族，包括Vβ1、Vβ2、Vβ3、Vβ4、Vβ5.1、Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ7.1、Vβ7.2、Vβ8、Vβ9、Vβ11、Vβ12、Vβ13.1、Vβ13.2、Vβ13.6、Vβ14、Vβ16、Vβ17、Vβ18、Vβ20、Vβ21.3、Vβ22、Vβ23。TCRVβ表達水平≥10%認為存在擴增，TCRVβ擴增程度以擴增個數(shù)(TCRVβ表達水平≥10%的片段個數(shù))及擴增分數(shù)(TCRVβ擴增分數(shù)=TCRVβ擴增的各個片段表達水平相加)表示。對TCRVβ擴增程度及TCRVβ 24個亞家族進行定性分析(該片段存在擴增者占總例數(shù)的百分比，以了解TCRVβ表達增高亞家族)及定量分析(該片段表達水平占總TCRVβ片段的百分比，以了解表達水平下降的TCRVβ亞家族)。

1.4統(tǒng)計學處理統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件，計數(shù)資料以率表示，采用卡方檢驗，兩兩比較采用卡方分割法(顯著性水平調整為α=0.008)；符合正態(tài)分布和方差齊性的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Bonferroni(LSD)檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，組間比較采用秩和檢驗，兩組間比較用Nemenyi法。以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組TCRVβ擴增程度CIS、RRMS及SPMS組總TCRVβ、CD4+TCRVβ、CD8+TCRVβ存在擴增患者比例、擴增個數(shù)、擴增分數(shù)均高于對照組(P<0.05)，而3種疾病組之間總TCRVβ、CD4+TCRVβ、CD8+TCRVβ的存在擴增患者比例、擴增個數(shù)、擴增分數(shù)間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結果見表1～3。

表1 各組TCRVβ存在擴增患者比例〔n(%)〕

注：TCRVβ：T淋巴細胞可變區(qū)β鏈，CIS：臨床孤立綜合征，RRMS：復發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化，SPMS：繼發(fā)-進展型多發(fā)性硬化；表2～8同。與對照組比較，aP<0.01

2.1.1TCRVβ定性分析：4組CD4+TCRVβ 2、7.1、9、13.1，CD8+TCRVβ 1、7.1、9、13.2、14片段存在擴增的例數(shù)百分比比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CIS組CD4+TCRVβ 2、CD8+TCRVβ 14，RRMS組CD4+TCRVβ 2，SPMS組CD4+TCRVβ 2、CD8+TCRVβ 9和13.2出現(xiàn)擴增者頻率高于對照組(P<0.008)。結果見表4～5。

2.1.2TCRVβ定量分析：CIS組、RRMS組、SPMS組及對照組間CD4+TCRVβ 1、2、4、5.3、13.2、14、17、20、21.3、23，CD8+TCRVβ 4、11、16片段表達水平占總TCRVβ片段百分比比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CIS組、RRMS組、SPMS組CD8+TCRVβ 11表達水平均低于對照組。SPMS組CD4+TCRVβ 21.3表達水平低于CIS組(P<0.05)。結果見表6～7。

表2 各組TCRVβ擴增個數(shù)比較

注：表中數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，表3、6、7同；與對照組比較，aP<0.01

表3 各組TCRVβ擴增分數(shù)比較

注：與對照組比較，aP<0.01

表4 各組CD4+TCRVβ 24個亞家族存在擴增者的頻率(%)

注：CD4+TCRVβ 3、5.3、11、12、13.6、14、16、18、20、21.3亞家族擴增頻率均為0，數(shù)據(jù)省略；與對照組比較，aP<0.008

表5 各組CD8+TCRVβ 24個亞家族存在擴增者的頻率(%)

注：CD8+TCRVβ 4、5.2、5.3、11、16、18、20、21.3、22數(shù)據(jù)均為0，結果省略；與對照組比較，aP<0.008

2.2血清各TCR片段的診斷價值根據(jù)上述定性分析和定量分析結果，將各組具有統(tǒng)計學差異的TCR片段繪制ROC曲線，并計算ROC曲線下面積(AUC)，結果顯示，CD8+TCRVβ 11的定量分析對MS(CIS+SPMS+RRMS)的診斷具有中等診斷價值(AUC=0.847，P<0.01)，對MS分型無診斷價值；CD4+TCRVβ 21.3的定量分析對SPMS診斷具有中等診斷價值(AUC=0.741，P=0.047)，而CD4+TCRVβ 2的定性分析對MS(包括CIS)的診斷價值較低(AUC=0.632，P=0.012)。

2.3外周血淋巴細胞檢測結果各組外周血淋巴細胞占有核細胞比例、T淋巴細胞占淋巴細胞比例、CD4+T細胞占T淋巴細胞比例、CD8+T細胞占T淋巴細胞比例及CD4+T細胞/CD8+T細胞比例間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表8)。

3 討論

臨床上MS根據(jù)病程分為CIS、RRMS、SPMS、PPMS 4種類型，其中RRMS最常見，RRMS患者以CIS形式起病，可看做是RRMS的早期階段，發(fā)病10年后40%～50%的RRMS型轉化為SPMS型。免疫活動存在于MS疾病的所有階段。

本研究發(fā)現(xiàn)，疾病組患者外周血TCRVβ有限制性擴增，存在擴增患者比例及擴增程度較健康對照顯著增高，這與MS的病理機制相一致。目前研究認為，MS發(fā)病的免疫病理機制為T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病，T淋巴細胞免疫活動基本通過T淋巴細胞受體實現(xiàn)，因此可以通過監(jiān)測TCR來監(jiān)測MS患者的免疫狀態(tài)[1-2]，TCRVβ片段具有高度特異性，可代表TCR的表達及表達水平。目前有關研究對象多為白種人群，比如Mandel等研究發(fā)現(xiàn)12例CIS患者(起病3個月內)外周血TCRVβ 6～9表達水平較對照組增高[4]；RRMS復發(fā)期患者外周血TCRVβ 4、5、7、9、11表達較對照組增高，外周血TCRVβ 3、27表達較對照組下降[5]；Buhler 等發(fā)現(xiàn)RRMS緩解期患者外周血TCRVβ 3、8表達較對照組增高[6]；Beall 等對83例SPMS患者外周血TCRVβ 8、11表達觀察發(fā)現(xiàn)其水平較對照組增高[7]。本研究結果顯示，與對照組相比，疾病組CD4+TCRVβ 2表達增高，CD8+TCRVβ 11表達下降；CIS組CD8+TCRVβ 14，SPMS組CD8+TCRVβ 9、13.2表達增高，SPMS組CD4+TCRVβ 21.3表達水平低于CIS組。產(chǎn)生這種差異可能與以下原因有關：(1)MS是一種免疫介導的異質性疾病，參與致病的抗原較多；從MS患者外周血分離出來的髓磷脂特異性T細胞可識別多種髓磷脂蛋白(如髓鞘堿性蛋白、髓鞘結合脂蛋白、髓鞘少突膠質細胞糖蛋白、少突膠質細胞髓鞘相關蛋白[8]等)；同時體內存在非髓磷脂特異性T淋巴細胞可識別αB晶體、神經(jīng)元蛋白接觸素-2[9]等抗原，T細胞同時或先后與一種或多種抗原產(chǎn)生免疫反應，造成不同類型的損害。(2)本研究患者除CIS外均為復發(fā)期，脫髓鞘疾病的復發(fā)可能與感染有關，某些TCRVβ片段的擴增可能是一過性存在[10]，患者出現(xiàn)的TCRVβ擴增片段可能是針對該次的感染性抗原。(3)種族差異性。

表6 各組CD4+TCRVβ 24個亞家族定量表達水平比較(%)

注：與CIS組比較，aP<0.05

表7 各組CD8+TCRVβ 24個亞家族定量表達水平比較(%)

注：與對照組比較，aP<0.05

表8 各組外周血淋巴細胞檢測結果(±s)

另外，本研究結果顯示，TCRVβ擴增程度在3個疾病組之間無統(tǒng)計學差異，反映脫髓鞘疾病患者外周血淋巴細胞數(shù)量及組成無統(tǒng)計學差異，T細胞免疫活動程度基本一致，但其功能發(fā)生異常[11]。Warabi等[12]通過對13例RRMS患者、8例SPMS患者(病程大于8年)，25名健康人研究發(fā)現(xiàn)，RRMS患者TCRVβ擴增個數(shù)與SPMS患者間存在差異〔(1.3±1.0)比(3.2±3.1)〕。本研究中，SPMS患者(病程3～13年)尚處于繼發(fā)進展階段的早期，可能尚未完全表現(xiàn)出TCRVβ擴增，導致各疾病組之間擴增個數(shù)無統(tǒng)計學差異。CIS患者亦存在TCRVβ擴增，提示在CIS階段即進行免疫調節(jié)治療具有一定意義，但外周血TCRVβ檢測能否作為CIS預后判斷指標需對CIS組患者定期隨訪，進一步研究予以證實。

該研究發(fā)現(xiàn)，CIS組、RRMS組、SPMS組出現(xiàn)擴增的TCRVβ者比例依次增多。有研究顯示，在MS早期階段TCRVβ擴增針對新抗原一過性存在，抗原刺激減退后，相應細胞群凋亡繼而數(shù)量下降，致病主要抗原或反復出現(xiàn)的抗原使TCRVβ持續(xù)存在且擴增[10]，并且隨疾病進展，抗原表位發(fā)生擴展；疾病早期抗原較為局限，隨疾病發(fā)展，致病抗原數(shù)量增多[11]。所以隨疾病進程發(fā)展，出現(xiàn)擴增的TCRVβ亞家族增多。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨疾病進程進展，表達水平下降的TCRVβ亞家族增多，這與MS病理機制中免疫調節(jié)異?？赡苡嘘P，數(shù)量減少的T細胞群可能對疾病有保護作用。健康人亦會出現(xiàn)TCRVβ擴增，存在擴增者比例、擴增程度顯著低于疾病組。有報道稱健康者擴增的TCRVβ與病毒感染有關，健康者髓鞘特異性T細胞處于休眠狀態(tài)的原始表型[3]，擴增的TCRVβ亞家族不會對髓磷脂抗原發(fā)生反應[12]，屬于正常擴增。

根據(jù)本研究結果顯示，MS不同階段患者外周血TCRVβ擴增程度增高，CD4+T細胞和CD8+T細胞均有TCRVβ擴增。3個疾病組的定性分析均高表達CD4+TCRVβ 2、定量分析均低表達CD8+TCRVβ 11；CD8+TCRVβ 11的定量分析對MS的診斷具有一定意義，但對MS分型無診斷價值；CD4+TCRVβ 21.3的定量分析對SPMS診斷具有一定意義。可通過檢測部分TCRVβ片段對MS及SPMS的早期診斷提供相關依據(jù)。更加深入的分型特異性研究需要后續(xù)如細胞因子檢測、抗原性檢測等進一步證實。這些TCRVβ亞家族有望可以做為治療靶點對MS進行免疫調節(jié)治療[13]。

[1]Allegretta M，Nicklas JA，Sriram S，et al. T cells responsive to myelin basic protein in patients with multiple sclerosis[J]. Science，1990，247(4943)：718-721.

[2]Venken K，Hellings N，Hensen K，et al. Memory CD4+CD127 high T cells from patients with multiple sclerosis produce IL-17 in response to myelin antigens[J].Neuroimmunol， 2010，226(1-2)：185-191.

[3]Frohman EM，Racke MK，Raine CS. Multiple sclerosis—the plaque and its pathogenesis[J]. N Engl J Med，2006，354(9)：942-955.

[4]Mandel M，Achiron A，Tuller T，et al. Clone clusters in autoreactive CD4 T-cell lines from probable multiple sclerosis patients form disease-characteristic signatures[J]. Immunology，2009，128(2)：287-300.

[5]Biegler BW，Yan SX，Ortega SB，et al. Clonal composition of neuroantigen-specific CD8+and CD4+T-cells in multiple sclerosis[J].Neuroimmunol，2011，234(1-2)：131-140.

[6]Buhler MM，Bennetts BH，Heard RN，et al. T cell receptor beta chain genotyping in Australian relapsing-remitting multiple sclerosis patients[J]. Mult Scler，2000，6(3)：140-147.

[7]Beall SS，Biddison WE，McFarlin DE，et al. Susceptibility for multiple sclerosis is determined，in part，by inheritance of a 175-kb region of the TCR V beta chain locus and HLA class Ⅱ genes[J].Neuroimmunol，1993，45(1-2)：53-60.

[8]Rosbo NK，Kaye JF，Eisenstein M，et al. The myelin-associated oligodendrocytic basic protein region MOBP15-36 encompasses the immunodominant major encephalitogenic epitope(s) for SJL/J mice and predicted epitope(s) for multiple sclerosis-associated HLA-DRB1*1501[J].Immunol，2004，173(2)：1426-1435.

[9]Derfuss T，Parikh K，Velhin S，et al. Contactin-2/TAG-1-directed autoimmunity is identified in multiple sclerosis patients and mediates gray matter pathology in animals[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(20)：8302-8307.

[10]Muraro PA，Jacobsen M，Necker A，et al. Rapid identification of local T cell expansion in inflammatory organ diseases by flow cytometric T cell receptor Vβ analysis[J]. Immunol Methods，2000，246：131-143.

[11]Fasso M. Anandasabapathy N. Crawford F, et al. T cell receptor (TCR)-mediated repertoire selection and loss of TCRVβ diversity during the initiation of a CD4+T cell response in vivo[J]. Exp Med，2000，92：1719-1730.

[12]Laplaud DA，Berthelot L，Miqueu P，et al. Serial blood T cell repertoire alterations in multiple sclerosis patients； correlation with clinical and MRI parameters[J].Neuroimmunol，2006，177(1-2)：151-160.

[13]Vandenbark AA，Culbertson NE，Bartholomew RM，et al. Therapeutic vaccination with a trivalent T-cell receptor (TCR) peptide vaccine restores deficient FoxP3 expression and TCR recognition in subjects with multiple sclerosis[J]. Immunology，2008，123(1)：66-78.