猴頭菇多糖對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下仔豬回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)及通透性的影響

張建龍，丘富安，董 星，秦 韜，馬玉芳，黃一帆*，李 健*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué) 福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2. 中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

氧化應(yīng)激作為誘發(fā)多種疾病的重要病理機(jī)制之一，導(dǎo)致畜禽生長(zhǎng)緩慢、體重下降、飼料利用率低，幼齡畜禽出現(xiàn)發(fā)育不良、腹瀉、腸道絨毛萎縮和隱窩增生、成活率低下等情況，對(duì)畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)生巨大影響。研究表明，中藥多糖作為免疫添加劑，對(duì)免疫系統(tǒng)具有廣泛的調(diào)節(jié)作用[1-3]。

人工誘發(fā)氧化應(yīng)激是一種常見(jiàn)的試驗(yàn)方法，常用的有大腸桿菌、沙門(mén)菌與高溫滅活的葡萄球菌三種氧化應(yīng)激原，其中大腸桿菌是使用最普遍的一種菌種，具體模型的建立是在試驗(yàn)豬腹膜或者靜脈注射一定劑量的大腸桿菌脂多糖(LPS)。脂多糖(LPS)是存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的致病成分，已有眾多研究使用LPS構(gòu)建細(xì)胞[4-6]和動(dòng)物[7-8]的氧化應(yīng)激模型。LPS既可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS，又是生豬氧化應(yīng)激繼發(fā)內(nèi)毒血癥過(guò)程中重要的毒力因子，因此更具生產(chǎn)實(shí)際意義。

猴頭菇(Hericiumerinaceus)是一種藥用食用菌，具有抗氧化、抗衰老、保肝利肝、提高免疫力等的功效[9-11]，因?yàn)榇罅康娜斯ぴ耘嗍沟闷涑杀窘档?，在日常食品中深受青睞。猴頭菇多糖(Hericiumerinaceuspolysaccharide，HEP)作為猴頭菇內(nèi)的主要活性物質(zhì)，在動(dòng)物保健和治療上有著良好的療效。然而，用HEP對(duì)豬腸道氧化應(yīng)激的研究目前還比較鮮少，因此，本試驗(yàn)利用LPS建立氧化應(yīng)激模型，來(lái)探究HEP對(duì)豬腸道氧化應(yīng)激作用的各方面影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選購(gòu)45頭健康的(28±3)日齡斷奶仔豬(杜洛克×長(zhǎng)白×大白)，猴頭菇多糖(HEP)：購(gòu)自上?？抵壅婢嗵怯邢薰?，純度為50%，脂多糖(LPS)：大腸桿菌血清型055：B5，Sigma公司提供，qPCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒由TaKaRa公司提供。其他試劑還有蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(cwbiotech 02912E)、蛋白marker(Biomed)、PVDF膜0.45 μm(Millipore)、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺(Amresco)、SDS(Sigma L4390)、HRP標(biāo)記山羊抗兔一抗(Jackson111-035-003)、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(Jackson115-035-003)等。

1.2 試驗(yàn)仔豬分組及處理

將45頭仔豬按體重相近原則隨機(jī)分為5個(gè)處理組：空白組、模型組(LPS)、0.2% HEP組、0.4% HEP組、0.6% HEP組，分別飼喂基礎(chǔ)日糧、基礎(chǔ)日糧、添加0.2%、0.4%、0.6% HEP的基礎(chǔ)日糧。每個(gè)處理組9個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭仔豬，試驗(yàn)周期21 d。第21天，分別對(duì)模型組、0.2% HEP組、0.4% HEP組、0.6% HEP組仔豬腹腔注射100 μg·kg-1BW脂多糖(LPS)，空白組注射等劑量滅菌生理鹽水(NS)。試驗(yàn)于福建莆田優(yōu)利可農(nóng)牧發(fā)展有限公司進(jìn)行，每天喂食3次，單欄飼養(yǎng)，圈舍自然通風(fēng)，且不定期進(jìn)行消毒。

1.3 樣品采集

注射LPS后第3小時(shí)，每個(gè)處理組隨機(jī)挑選3頭試驗(yàn)豬，前腔靜脈采血15 mL左右，2 000 r·min-1離心20 min分離血清，用于檢測(cè)抗氧化指標(biāo)以及谷氨酰胺和二胺氧化酶。試驗(yàn)豬于采血完成后立即宰殺，從腹腔內(nèi)取3～5 cm的回腸；取部分腸組織置于10%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定，用于制作切片；另取部分腸組織置于液氮中凍存，用于檢測(cè)緊密連接相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

1.4 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒(可見(jiàn)光法)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)測(cè)定試劑盒(比色法)、總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(WST-1法)和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(TBA法)，購(gòu)自南京建成生物工程研究所，采用分光光度法測(cè)定，詳細(xì)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求完成。

1.5 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸血清GLN含量和DAO活性的影響

谷氨酰胺(GLN)試劑盒和二胺氧化酶(DAO)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，采用改良分光光度法，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定回腸中谷氨酰胺(GLN)和二胺氧化酶(DAO)活性。

1.6 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

將保存在4%多聚甲醛的小腸組織經(jīng)過(guò)“浸洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烘干→脫蠟入水”制備石蠟切片后，通過(guò)蘇木精-伊紅(HE)染色。每張切片選取2個(gè)視野，每個(gè)視野連續(xù)測(cè)定10 根腸絨毛，運(yùn)用Imageproplus6.0軟件計(jì)算腸絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.7 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸緊密連接的影響

1.7.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 RNA的提取按照組織勻漿研磨的方法，將提取出的總RNA溶于DEPC水中測(cè)定其OD值，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間的說(shuō)明其純度相對(duì)較高，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增后取8 μL·孔-1的PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂凝膠電泳試驗(yàn)。

1.7.2 RT-PCR測(cè)定 根據(jù)GenBank中豬源Occludin、Claudin和ZO-1全長(zhǎng)序列，用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，采用12.5 μL的體系，將反應(yīng)液加到Real Time PCR管內(nèi)進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)：98 ℃ 2 min 初期變性；98 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、68 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用雙△Ct+標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率校正法，用10倍梯度稀釋法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，計(jì)算公式為相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照組。

表1基因的擴(kuò)增引物序列

Table1Geneamplificationprimersequence

基因Gene引物序列(5'→3')Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpLengthofproducts登錄號(hào)AccessionNo.GAPDHForward:ACATCATCCCTGCTTCTACTGGReversed:CTCGGACGCCTGCTTCAC188AF017079OccludinForward:ACGAGCAGCAAAGGGATTCTTCReversed:TCACACCCAGGATAGCACTCATT152NM_001163647.2ClaudinForward:TGCCTCAGTGGAAGATTTACTCCReversed:TGGTGTTCAGATTCAGCAAGGA147NM_001244539.1ZO-1Forward:AGTTTGATAGTGGCGTTGACACReversed:GCTGAAGGACTCACAGGAACA106XM_005659811.1

1.7.3 Western blot檢測(cè) RIPA buffer提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，按照Braford蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的濃度，使用山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1∶10 000，室溫孵育1 h。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以5% BSA-PBST稀釋一抗后4 ℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日用5%BSA-PBST稀釋二抗，加入1∶10 000的山羊抗兔IgG(H+L)HRP室溫孵育1 h，加入ECL曝光顯影。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有指標(biāo)均以孔為統(tǒng)計(jì)單位，采用Excel對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)和Duncan氏多重比較,以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響結(jié)果如圖1所示。根據(jù)圖1A所知，經(jīng)處理過(guò)的各組血清中的CAT含量顯著低于空白組(P<0.05)，0.6% HEP組顯著高于LPS組(P<0.05)。根據(jù)圖1B所知，處理過(guò)的各組血清中SOD的含量顯著低于空白組(P<0.05)，0.6% HEP組顯著高于LPS組(P<0.05)。根據(jù)圖1C可知，處理過(guò)的各組血清中的GSH-Px含量顯著低于空白組(P<0.05)，HEP組顯著高于LPS組(P<0.05)。根據(jù)圖1D可知，各組血清中的MDA的含量相比較，0.2%、0.4% HEP組相比空白組顯著升高(P<0.05)，LPS組和0.6% HEP組相比空白組極顯著升高(P<0.01)，各HEP組比LPS組顯著降低(P<0.05)。

與空白對(duì)照組比較，*. P<0.05，**. P<0.01；與LPS組比較，#. P<0.05，##. P<0.01；下同。A. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清CAT的影響；B. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清SOD的影響；C. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清GSH-Px的影響；D. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清MDA的影響Compared with control group, *. P<0.05, **. P<0.01; Compared with LPS group, #. P<0.05, ##. P<0.01; The same as follows. A. Effects of HEP on serum CAT in oxidative stress piglets; B. Effects of HEP on serum SOD in oxidative stress piglets; C. Effects of HEP on serum GSH-Px in oxidative stress piglets; D. Effects of HEP on serum MDA in oxidative stress piglets圖1 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of HEP on serum antioxidant indexes in oxidative stress piglets(±s, n=3)

2.2 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清GLN含量和DAO活性的影響

HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清GLN含量和DAO活性的影響結(jié)果如圖2所示。各組間血清中谷氨酰胺的含量由圖2A所知，LPS處理組的GLN水平顯著低于空白組(P<0.05)，經(jīng)HEP處理后的各組GLN水平顯著高于LPS組(P<0.05)。圖2B反映了各組血清中DAO的含量變化情況，LPS組的DAO水平極顯著高于空白組(P<0.01)，HEP處理組的DAO水平顯著低于LPS組(P<0.05)。

A. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清谷氨酰胺含量的影響；B. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清二胺氧化酶活性的影響A. Effects of HEP on serum GLN in oxidative stress piglets; B Effects of HEP on serum DAO in oxidative stress piglets圖2 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清GLN含量和DAO活性的影響Fig.2 Effects of HEP on serum GLN and DAO in oxidative stress piglets(±s, n=3)

2.3 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸結(jié)構(gòu)的影響如圖3所示。圖3A表示HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸絨毛的影響，其中，a圖表示絨毛的高度，空白組極顯著地高于其余各組(P<0.01)，LPS組極顯著低于其余各組(P<0.01)；b圖表示隱窩的深度，空白組極顯著低于其余各組(P<0.01)，LPS組顯著高于0.2% HEP組(P<0.05)，極顯著地高于0.4%、0.6% HEP組(P<0.01)；c圖表示絨毛高度/隱窩深度的情況，空白組極顯著高于其余各組(P<0.01)，LPS組極顯著地低于其余各組(P<0.01)。

圖3B反映了HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，由圖b可見(jiàn)：回腸組織絨毛上皮細(xì)胞的單層柱狀上皮細(xì)胞局部糜爛脫落，隱窩結(jié)構(gòu)受損，黏 膜層局部區(qū)域隱窩結(jié)構(gòu)消失，組織疏松，表明造模成功。圖c、d、e均顯示：回腸上皮絨毛上皮細(xì)胞可見(jiàn)少量脫落，隱窩結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層及黏膜下層結(jié)構(gòu)較正常，高劑量HEP組和空白組的結(jié)果基本相似。

A. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸絨毛的影響；B. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(圖a～e分別為空白組、LPS組、0.2%HEP組、0.4%HEP組和0.6%HEP組)，100×A. Effects of HEP on ileal villi of oxidative stress piglets; B. Effects of HEP on ileal morphology of oxidative stress piglets (Fig. a-e were control group, LPS group, 0.2% HEP group, 0.4% HEP group and 0.6% HEP group, respectively), 100×圖3 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of HEP on ileal morphology of oxidative stress piglets(±s, n=3)

2.4 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸緊密連接蛋白mRNA的影響

HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸緊密連接的影響結(jié)果如圖4。圖4A表示HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬緊密連接基因轉(zhuǎn)錄的影響，可知：LPS組的3種緊密連接(tight junction，TJ)基因轉(zhuǎn)錄量極顯著地低于空白組的轉(zhuǎn)錄量(P<0.01)。0.4% HEP組的ZO-1 mRNA和ClaudinmRNA轉(zhuǎn)錄量極顯著地高于LPS組(P<0.01)，0.2%、0.6% HEP組顯著高于LPS組(P<0.05)；0.2% HEP組的OccludinmRNA轉(zhuǎn)錄量顯著高于LPS組(P<0.05)，但極顯著低于其他2個(gè)HEP組和空白組(P<0.01)；0.4%、0.6% HEP組極顯著地高于LPS組(P<0.01)。

HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬緊密連接蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如圖4 B和C所示。根據(jù)圖4C可以看出，三組TJ蛋白相對(duì)表達(dá)量中，LPS組均極顯著地低于空白組(P<0.01)。各HEP組的Claudin蛋白、Occludin蛋白極顯著地低于空白組(P<0.01)，0.2%、0.4% HEP組ZO-1蛋白極顯著地低于空白組(P<0.01)，0.6% HEP組顯著低于空白組(P<0.05)。各HEP組三種TJ蛋白表達(dá)量(除0.2% HEP組Claudin外)均極顯著(P<0.01)高于LPS值。

3 討 論

3.1 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

MDA、SOD、GSH-Px、CAT是動(dòng)物機(jī)體抗氧化系統(tǒng)成分，用以清除氧自由基，從而調(diào)節(jié)氧自由基的生成和清除之間的動(dòng)態(tài)平衡[12-14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激狀態(tài)下的仔豬血清中的抗氧化指標(biāo)有了明顯變化，SOD、GSH-Px、CAT指數(shù)下降和MDA指數(shù)升高，飼料中添加HEP后，這些指標(biāo)都在向著正常的趨勢(shì)逐漸發(fā)展，這說(shuō)明HEP具有一定抗氧化的能力，且濃度的不同所造成的影響也不同，中等劑量的HEP有著較好的抗氧化應(yīng)激能力。

A. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬緊密連接基因轉(zhuǎn)錄的影響；B. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬緊密連接蛋白表達(dá)的影響；C. HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬緊密連接蛋白相對(duì)表達(dá)結(jié)果A. Effects of HEP on TJ gene transcription of oxidative stress piglets; B. Effects of HEP on TJ protein expression of oxidative stress piglets; C. Effects of HEP on TJ protein relative expression圖4 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬緊密連接蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of HEP on expression of tight junction in ileum from oxidative stress piglets(±s, n=3)

3.2 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸黏膜完整性的影響

小腸是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)和預(yù)防疾病的重要組織器官，小腸絨毛是其發(fā)揮生理功能的基本功能單位，腸絨毛高度、隱窩深度和V/C是小腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性的重要衡量指標(biāo)[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS應(yīng)激嚴(yán)重破壞了仔豬小腸黏膜形態(tài)的完整性，使小腸黏膜功能受損，在添加了HEP之后，隨著劑量的升高，腸黏膜的形態(tài)明顯出現(xiàn)改善。同時(shí)，根據(jù)絨毛高度、隱窩深度和V/C值可以分析出，HEP具有保護(hù)腸黏膜的作用，增強(qiáng)腸黏膜對(duì)氧化應(yīng)激的抵御能力，使腸道的結(jié)構(gòu)和功能保持完整。

GLN是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一類(lèi)條件必需氨基酸，它能有效保護(hù)腸道黏膜結(jié)構(gòu)，防止黏膜萎縮，改善腸道免疫功能[16]，因此，血漿中GLN活性可直接反映腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性。DAO是一種具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，跟小腸黏膜中核酸、蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)，可作為腸道黏膜結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)的理想指標(biāo)，其含量與腸道損傷程度呈正相關(guān)，與腸黏膜DAO活性呈負(fù)相關(guān)[17-19]。LPS的刺激，導(dǎo)致仔豬產(chǎn)生氧化應(yīng)激，在破壞腸道結(jié)構(gòu)的同時(shí)，引起機(jī)體GLN含量的下降和DAO含量的升高。通過(guò)在日糧中添加HEP的試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的HEP對(duì)GLN和DAO均有一定程度的影響，使受損的腸黏膜得到一些改善。

3.3 HEP對(duì)氧化應(yīng)激仔豬回腸緊密連接的影響

緊密連接是保護(hù)腸黏膜屏障和腸上皮細(xì)胞間最主要的連接方式，對(duì)緊密連接起關(guān)鍵作用的是連接蛋白ZO-1、Claudin、Occludin[20-22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS應(yīng)激后，回腸中ZO-1、Claudin、Occludin蛋白表達(dá)量均顯著下降，飼料中添加HEP后，下降程度得到顯著抑制。這表明LPS的應(yīng)激破壞了仔豬回腸上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，而HEP能抑制經(jīng)LPS應(yīng)激后腸上皮細(xì)胞緊密連接mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)量的下降，提高緊密連接基因表達(dá)量，從而保護(hù)腸黏膜屏障功能。

4 結(jié) 論

日糧中添加猴頭菇多糖能緩解氧化應(yīng)激造成的回腸黏膜損傷，維持腸上皮細(xì)胞通透性。

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