禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒感染SPF雛雞血液淋巴細(xì)胞增殖功能及其細(xì)胞周期相關(guān)因子變化

王曉燕，劉文超，付禮勝，高雪麗，劉超男，呂曉萍，鄭世民

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(reticuloendotheliosis，RE)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)感染引起的一種免疫抑制和慢性腫瘤增生性疾病。近年來，國(guó)內(nèi)外雞群中REV流行有增加趨勢(shì)，REV常與馬立克病病毒(MDV)、J亞群禽白血病病毒(ALV-J)和雞貧血病病毒(CAV)等幾種重要的禽類免疫抑制病病毒混合感染，使感染雞免疫功能降低甚至喪失，導(dǎo)致免疫抑制[1-2]。我國(guó)部分地區(qū)的養(yǎng)雞場(chǎng)普遍存在REV感染，并繼發(fā)禽流感、新城疫等一些致死性疫病，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，通過細(xì)胞周期，細(xì)胞進(jìn)入增殖、分裂、衰老和死亡等生理過程[4]。細(xì)胞周期調(diào)控是經(jīng)其不同時(shí)相中各種特定的細(xì)胞周期蛋白(即細(xì)胞周期素)來實(shí)現(xiàn)的，其中Cyclin D1是G1期必不可少的啟動(dòng)蛋白，能促使細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入到S期[5]。細(xì)胞周期調(diào)控依賴于細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)的活化，Cyclin D1是CDK的正向調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑(CDKI)是CDK的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。p27是CDKI中p21家族重要成員之一，其對(duì)CDK具有廣譜抑制作用，與CDK-cyclin復(fù)合物結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[6]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期不但參與機(jī)體正常的生長(zhǎng)、發(fā)育以及繁殖，而且與某些病毒感染和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。病毒感染細(xì)胞時(shí)，病毒編碼的DNA或蛋白質(zhì)會(huì)干擾細(xì)胞周期的啟動(dòng)，使正常細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。REV感染對(duì)SPF雛雞血液淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期及其相關(guān)因子表達(dá)的影響，迄今未見系統(tǒng)報(bào)道。故本研究對(duì)SPF雛雞感染REV后，其外周血液中T、B淋巴細(xì)胞增殖功能及其細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)進(jìn)行了較全面系統(tǒng)的檢測(cè)，為深入闡述REV感染雛雞的分子發(fā)病機(jī)制和開發(fā)抗病毒新藥提供理論依據(jù)，也可為進(jìn)一步探討病毒感染對(duì)免疫細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡SPF混合雛雞80只，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 病毒 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(REV-T株)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC No. CACCAV107)，通過雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞，對(duì)病毒進(jìn)行復(fù)壯，測(cè)定TCID50為10-4.62·0.1 mL-1。

1.1.3 主要試劑和儀器 鼠抗雞Cyclin D1抗體(LifeSpan公司)；CCK-8試劑盒(碧云天生物有限公司)；ELx808酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；LightCycler2. 0熒光定量PCR儀(美國(guó)羅氏公司)；PTC-200 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；GDS800凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及其處理 將80只SPF雛雞隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組(C組)和REV感染組(I組)，每組各40只雛雞。在1日齡時(shí)，I組雛雞經(jīng)腹腔注射REV稀釋液，0.5 mL·只-1；C組雛雞經(jīng)腹腔注射等量滅菌生理鹽水。兩組雛雞分別飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，按SPF雛雞要求飼養(yǎng)管理。

1.2.2 被檢材料采取及其處理 兩組雛雞分別于REV感染后1、3、7、14、21、28和42 d，每組隨機(jī)抽取5只雛雞，無菌采取心臟肝素抗凝血液，用于分離淋巴細(xì)胞，并將其濃度調(diào)整為1×107·mL-1后做如下處理：

(1)取1 mL細(xì)胞懸液，于4 ℃恒溫離心機(jī)上，2 000 r·min-1，離心5 min。棄上清，加入1 mL Trizol，混勻靜止10 min，液氮速凍后，-80 ℃冰箱中保存，用于CyclinD1和p27 mRNA轉(zhuǎn)錄檢測(cè)。

(2)同上(1)收集細(xì)胞沉淀，加入200 μL裂解液，裂解5 min，10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清加入EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存，用于Cyclin D1蛋白含量檢測(cè)。

(3)取部分細(xì)胞懸液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入50 μL，再于每孔中分別加入含20 μg·mL-1ConA或LPS的RPMI1640培養(yǎng)液50 μL，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，且每組3個(gè)重復(fù)，在飽和濕度、溫度37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，加入10 μL CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h后，待檢。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.3.1 Real-Time PCR法檢測(cè)淋巴細(xì)胞CyclinD1和p27 mRNA 變化：取預(yù)凍存細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，溶于20 μL DEPC處理水，用于cDNA的合成。根據(jù)PrimeScriptTM試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存。

RT-PCR反應(yīng)體系20 μL：SYBR?Premix ExTaqTMII 10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA 2 μL，無菌純凈水6.8 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 10 s，退火(CyclinD1 60℃、p27 58 ℃、β-actin57 ℃)20 s，延伸72 ℃ 20 s，循環(huán)45次，進(jìn)行熒光信號(hào)采集，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。CyclinD1、p27 mRNA、β-actin引物序列見表1，β-actin作為內(nèi)參基因，所有引物均由上海生物工程有限公司合成。

表1各基因引物序列

Table1Theprimersequencesofgenes

引物Primer序列(5'-3')SequencePCR產(chǎn)物/bpProductCyclinD1(P1)CyclinD1(P2)TGCAGAAGGAAATCTTGCCATGTCTGATGGAGTTGTCGGTGT258p27(P3)p27(P4)TCGCCCGACTTCTACTTCAGCCAGCAACATCAGTCTTTCG167β-actin(P5)β-actin(P6)TGAAGCCCAGAGCAAAAGAGGTATTGCTCCTCAGGGCTACTCTC135

1.2.3.2 Western Blot檢測(cè)淋巴細(xì)胞Cyclin D1蛋白含量變化：以α-Tubulin作為內(nèi)參蛋白并用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取40 μg蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，半干轉(zhuǎn)到NC膜上，5%脫脂乳中37 ℃恒溫封閉1.5 h，PBST洗3次膜，10 min·次-1；加入1∶500稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，PBST洗3次膜，10 min·次-1；加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次膜，10 min·次-1；使用ECL發(fā)光液曝光。

1.2.3.3 淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè)——CCK-8試劑盒法：根據(jù)CCK-8檢測(cè)試劑盒(碧云天)說明書操作，于酶標(biāo)儀上測(cè)定，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度值，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每孔重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果取其平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 REV感染SPF雛雞外周血液T、B淋巴細(xì)胞增殖能力變化

2.1.1 REV感染SPF雛雞外周血液的T淋巴細(xì)胞增殖能力變化 REV感染SPF雛雞后14～21 d，其外周血液的T淋巴細(xì)胞增殖能力顯著(P<0.05)低于相應(yīng)對(duì)照組雛雞，其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

C.對(duì)照組； I.REV感染組；下同C.Control group; I.Groups infected with REV; The same below圖1 REV感染雛雞外周血液的T淋巴細(xì)胞增殖能力變化Fig.1 Changes of T lymphocytes proliferative function in peripheral blood of SPF chicks infected with REV

2.1.2 REV感染SPF雛雞外周血液的B淋巴細(xì)胞增殖能力變化 REV感染SPF雛雞后7～14 d，其外周血液B淋巴細(xì)胞增殖能力顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)低于對(duì)照組雛雞，其余盡管病毒感染雛雞低于相應(yīng)對(duì)照組雛雞，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

圖2 REV感染雛雞外周血液的B淋巴細(xì)胞增殖能力變化Fig.2 Changes of B lymphocytes proliferative function in peripheral blood of SPF chicks infected with REV

2.2 REV感染SPF雛雞外周血液淋巴細(xì)胞中Cyclin D1和p27轉(zhuǎn)錄變化

2.2.1 REV感染SPF雛雞外周血液淋巴細(xì)胞中CyclinD1轉(zhuǎn)錄變化 REV感染SPF雛雞后21～42 d，其外周血液淋巴細(xì)胞中CyclinD1 轉(zhuǎn)錄顯著(P<0.05)高于對(duì)照組雛雞，其余時(shí)間點(diǎn)雖然病毒感染雛雞不同程度高于對(duì)照組雛雞，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 REV感染SPF雛雞外周血液淋巴細(xì)胞Cyclin D1轉(zhuǎn)錄變化Fig.3 Changes of Cyclin D1 transcription of lymphocytes in peripheral blood of SPF chicks infected with REV

2.2.2 REV感染SPF雛雞外周血液淋巴細(xì)胞中p27轉(zhuǎn)錄變化 REV感染SPF雛雞后7～14 d，其外周血液淋巴細(xì)胞中p27轉(zhuǎn)錄顯著(P<0.05)高于對(duì)照組雛雞，病毒感染后28～42 d，其外周血淋巴細(xì)胞中p27轉(zhuǎn)錄顯著(P<0.05)低于對(duì)照組雛雞，其余時(shí)間點(diǎn)雖然病毒感染雛雞不同程度高于或低于對(duì)照組雛雞，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖4)。

圖4 REV感染SPF雛雞外周血液淋巴細(xì)胞p27轉(zhuǎn)錄變化Fig.4 Changes of p27 mRNA transcription of lymphocyte in peripheral blood of SPF chicks infected with REV

2.3 REV感染SPF雛雞外周血液淋巴細(xì)胞中Cyclin D1 蛋白含量變化

REV感染SPF雛雞后，其外周血液淋巴細(xì)胞中Cyclin D1蛋白含量于病毒感染初期變化不明顯，于感染后21～42 d明顯(P<0.05)高于對(duì)照組雛雞(圖5、6)。

圖5 REV感染SPF雛雞外周血中淋巴細(xì)胞Cyclin D1蛋白含量變化Fig.5 Changes of Cyclin D1 content of lymphocytes in peripheral blood of SPF chicks infected with REV

圖6 REV感染SPF雛雞外周血中淋巴細(xì)胞Cyclin D1/α-Tubulin灰度比值變化Fig.6 Changes of densitometry ratio of Cyclin D1 to α-Tubulin in lymphocytes of peripheral blood of SPF chicks infected with REV

3 討 論

Cyclin D1是G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白。在正常細(xì)胞周期中，細(xì)胞周期蛋白Cyclin、CDK和CDKI三者組成“驅(qū)動(dòng)器”，通過對(duì)靶蛋白的調(diào)控進(jìn)而推動(dòng)細(xì)胞周期中各時(shí)相的進(jìn)展與轉(zhuǎn)變[13]。Cyclin D1可與CDK4/6結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞周期S期有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞通過G1/S期限制點(diǎn)[14]。病毒感染對(duì)宿主細(xì)胞周期的影響主要表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞增殖。W.G.Feng等[15]發(fā)現(xiàn)，ALV-J感染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)通過下調(diào)G1/S期的啟動(dòng)因子Cyclin D1及其非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，明顯抑制CEF增殖。徐彥波等[16]研究表明，CIV感染雛雞，其胸腺和骨髓細(xì)胞阻滯于G1期，抑制主要免疫細(xì)胞和造血干細(xì)胞增殖，導(dǎo)致雞呈現(xiàn)免疫抑制和貧血病理綜合征。本研究發(fā)現(xiàn)，REV感染1日齡SPF雛雞后，在病毒感染后期，其外周血液淋巴細(xì)胞Cyclin D1在mRNA和蛋白質(zhì)水平均不同程度地高于對(duì)照組雛雞，而在病毒感染初期淋巴細(xì)胞增殖能力受到抑制。RE病毒感染初期，引起宿主細(xì)胞損傷，使細(xì)胞處于G1期的檢查點(diǎn)阻滯，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，也可能是病毒感染激活細(xì)胞凋亡及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖能力降低。然而，在病毒感染后期，Cyclin D1 mRNA表達(dá)及其蛋白含量增加，可能與REV特性有關(guān)，該病毒是一種病毒性致瘤病毒，其病毒基因及其產(chǎn)物作用于細(xì)胞周期蛋白，促使宿主細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞對(duì)多種生長(zhǎng)抑制信號(hào)的反應(yīng)性減弱或喪失，故而細(xì)胞繼續(xù)增殖，T. Sanda等[17]研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞白血病病毒能夠持續(xù)激活NF-κB及其下游信號(hào)通路，上調(diào)Cyclin D1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。也可能是REV在機(jī)體內(nèi)的增殖達(dá)到峰值，改變宿主細(xì)胞的周期進(jìn)程，為病毒自身增殖創(chuàng)造了微環(huán)境，因此Cyclin D1蛋白的表達(dá)量增加。李凌云[18]研究發(fā)現(xiàn)，人皰疹病毒6型感染HSB2細(xì)胞，病毒可改變后者細(xì)胞周期進(jìn)程，為病毒生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了內(nèi)在環(huán)境。在EBV誘導(dǎo)的鼻咽癌中，Cyclin D1蛋白的過表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[19]。上述腫瘤病毒在宿主細(xì)胞中的增殖，都是通過上調(diào)Cyclin D1蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。病毒引發(fā)的腫瘤性疾病與Cyclin D1高表達(dá)密切相關(guān)。

REV感染SPF雛雞后期，Cyclin D1蛋白含量雖然高表達(dá)，但其發(fā)揮啟動(dòng)細(xì)胞周期活性還需要與CDK結(jié)合。CDKI可抑制Cyclin與CDK的結(jié)合，作為CDKI家族的主要成員的p27，其可與Cyclin D1競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合CDK4，也可與Cyclin D1/CDK4復(fù)合物結(jié)合，從而對(duì)細(xì)胞增殖發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[20]。迄今為止，關(guān)于雛雞淋巴細(xì)胞 p27表達(dá)的研究尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，REV感染SPF雛雞后，其外周血液淋巴細(xì)胞p27 mRNA在病毒感染前期明顯高于對(duì)照組雛雞。劉潤(rùn)[21]報(bào)道，在胃黏膜上皮細(xì)胞中，p27通過抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞周期調(diào)控。Z.Q.Yu等[22]經(jīng)高通量測(cè)序表明，REV感染SPF雞后，其p27表達(dá)明顯上調(diào)，并促進(jìn)雛雞免疫器官的細(xì)胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，REV感染SPF雛雞后期，其外周血液淋巴細(xì)胞p27 mRNA轉(zhuǎn)錄明顯下降。p27在增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)其含量很低，p27的低表達(dá)表明，其抑制細(xì)胞分裂、分化及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力減弱，其與Cyclin D1-CDK復(fù)合物結(jié)合量下降[23]。在胸腺惡性腫瘤中，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中p27表達(dá)的降低，結(jié)果促進(jìn)細(xì)胞增殖[24]。在胃腺癌腺細(xì)胞中，p27陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組樣本，其與腺細(xì)胞增殖異常密切相關(guān)[25]。綜上研究結(jié)果可知，Cyclin D1、p27含量變化的原因可能是：在病毒感染早期，p27表達(dá)上調(diào)促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡，引起T、B淋巴細(xì)胞增殖能力降低；而病毒感染后期，由于病毒的致瘤性，導(dǎo)致Cyclin D1表達(dá)增加，p27表達(dá)含量明顯降低，上述病理改變與REV的免疫致病性及其致瘤性有關(guān)。

4 結(jié) 論

REV感染SPF雛雞后，其外周血液T、B淋巴細(xì)胞增殖能力下降、Cyclin D1 mRNA表達(dá)及其蛋白質(zhì)含量增加而p27 mRNA表達(dá)下降與REV的免疫致病機(jī)制密切相關(guān)。

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