非HLA抗體在腎臟移植中作用的研究進(jìn)展①

楊關(guān)印 連 鑫 周洪瀾 傅耀文 高寶山

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，長春 130021)

抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(Antibody mediated rejection，AMR)是腎移植術(shù)后影響移植腎功能的常見并發(fā)癥，并阻礙移植腎長期存活[1-4]。腎臟移植物體液免疫的主要靶點(diǎn)是多態(tài)性的HLA抗原，然而有研究發(fā)現(xiàn)，在AMR過程中存在直接針對非HLA抗原的抗體。最令人信服的證據(jù)來源于針對同卵雙生子腎臟移植的研究，該研究發(fā)現(xiàn)，同卵雙生子腎移植受者仍可發(fā)生AMR[5]。與之類似，有研究顯示，針對非HLA抗原的免疫反應(yīng)與較差的移植物長期存活率密切相關(guān)。有兩個(gè)應(yīng)用獨(dú)立數(shù)據(jù)的多中心研究，針對HLA半相合的親屬移植研究后發(fā)現(xiàn)，受者如果術(shù)前存在細(xì)胞毒抗體，則移植后移植物遠(yuǎn)期存活率將降低。這一發(fā)現(xiàn)說明非HLA免疫在移植物慢性排斥過程中也發(fā)揮著重要作用[6,7]。

在對移植物免疫反應(yīng)過程中出現(xiàn)的自身抗體，其特異性多種多樣。值得關(guān)注的是，盡管伴隨器官移植會(huì)產(chǎn)生諸多自身抗體，但大部分移植患者并未出現(xiàn)排斥反應(yīng)或移植物功能障礙。此現(xiàn)象說明，自身抗體的致病性也取決于其他因素諸如配體的表達(dá)、缺血再灌注損傷和/或移植物微環(huán)境的炎癥狀態(tài)。對于器官移植受者發(fā)生的非HLA抗體介導(dǎo)的移植物排異反應(yīng)，鑒定出免疫反應(yīng)的表型、并對此類排斥反應(yīng)制定針對性的策略，將顯著提高移植物及移植受者的存活率。本綜述中，我們將集中研究已經(jīng)被鑒定的幾種自身抗體，以探討其在腎移植致病作用中的可能機(jī)制。

1 血管緊張素1類受體

1.1血管緊張素1類受體在腎臟移植中的臨床研究 血管緊張素1類受體(Angiotensin type 1 receptor，AT1R)是一類表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面的G-蛋白耦聯(lián)受體，可與血管緊張素Ⅱ結(jié)合并調(diào)節(jié)水-鹽平衡及血壓[8]。AT1R的過度活動(dòng)將導(dǎo)致高血壓、血管收縮及血管平滑肌增殖[9]。AT1R抗體首先在導(dǎo)致母體及胎兒致病致死的先兆子癇中被發(fā)現(xiàn)[10]。在腎移植領(lǐng)域有學(xué)者第一次報(bào)道，在嚴(yán)重的耐激素型血管性排斥及惡性高血壓的腎移植患者中，HLA供體特異性抗體(HLA donor specific antibody，HLA-DSA)檢測為陰性，但AT1R抗體水平顯著升高[11]。在該研究中，13例患者DSA陽性，而其余20例患者DSA陰性。在DSA陰性的患者群中，有16例患者AT1R抗體陽性并表現(xiàn)為血管損傷和惡性高血壓。盡管AT1R抗體是IgG1和IgG3，但抗AT1R陽性并出現(xiàn)血管性排斥患者的移植物活檢并未發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體沉積的證據(jù)。與標(biāo)準(zhǔn)的抗排斥治療方案相比，對AT1R抗體陽性的患者給予血漿置換、靜脈注射免疫球蛋白及氯沙坦等綜合治療，可顯著改善移植物存活率。此結(jié)果說明AT1R抗體可介導(dǎo)血管損傷。

隨后的研究證實(shí)了這個(gè)初始發(fā)現(xiàn)，顯示AT1R抗體與AMR發(fā)生率升高及移植物功能損害密切相關(guān)[12-15]。例如，在一項(xiàng)針對97例HLA DSA陰性或MICA DSA陰性的腎移植患者的研究中發(fā)現(xiàn)，AT1R抗體及AMR的發(fā)病率呈很強(qiáng)的相關(guān)性[16]。研究者發(fā)現(xiàn)，在診斷為AMR并且移植術(shù)前及發(fā)生排斥時(shí)AT1R抗體陽性(>17 U/ml)的7例患者中，有6例患者AT1R抗體強(qiáng)度與AMR呈正相關(guān)。而診斷為急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)的9例患者發(fā)生排斥時(shí)AT1R抗體陰性。值得關(guān)注的是，6例AT1R陽性的AMR患者中，僅有1例移植物活檢表現(xiàn)為C4d陽性，再次說明非補(bǔ)體依賴途徑介導(dǎo)了移植物損傷。

Giral等[17]報(bào)道，599例腎移植受者中超過45%的受者移植術(shù)前AT1R抗體>10 U/ml。AT1R抗體陽性與移植術(shù)后4個(gè)月之內(nèi)的急性排斥反應(yīng)呈正相關(guān)，而且移植術(shù)后3年以上的移植物失功風(fēng)險(xiǎn)上升了2.6倍，說明AT1R抗體可能影響移植物長期存活[17]。在一項(xiàng)針對351例連續(xù)腎移植病例有關(guān)移植術(shù)前及術(shù)后AT1R抗體的研究，設(shè)定AT1R的臨界值為15 U/ml[18]，研究顯示，有35例受者移植術(shù)前AT1R抗體陽性，但術(shù)后轉(zhuǎn)為陰性，未對移植物存活產(chǎn)生影響。相反，25例受者中有12例(48%)術(shù)前及術(shù)后AT1R抗體均為陽性，11例中有7例(64%)移植后出現(xiàn)新生AT1R抗體，而這些患者出現(xiàn)了移植物失功。而且與單純HLA-DSA陽性的患者相比，AT1R抗體和HLA-DSA均陽性的患者移植物存活率更低，說明AT1R抗體與HLA抗體可能存在協(xié)同作用[18]。諸多研究報(bào)道的移植術(shù)前AT1R抗體的陽性率較高，但變異較大，從17%至59%不等，變異度較大的可能原因是檢測AT1R抗體的方法不同且設(shè)定的臨界值不同。

1.2血管緊張素1類受體介導(dǎo)損傷的機(jī)制 盡管腎移植中發(fā)現(xiàn)的AT1R抗體被鑒定為IgG1和IgG3亞型，但C4d沉積只在少部分腎移植患者中存在，說明此類抗體的致病作用包含非補(bǔ)體依賴途徑[11,16]。Dragun等[11]研究顯示，抗體與AT1R結(jié)合后，會(huì)模仿血管緊張素Ⅱ的活性并促進(jìn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的磷酸化以及激活內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κβ。在大鼠移植模型中，過繼輸注激動(dòng)性AT1R抗體可以導(dǎo)致高血壓病誘發(fā)移植物血管改變：包括動(dòng)脈內(nèi)膜炎及血管內(nèi)浸潤[11]。綜合這些臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持如下假設(shè)：與AT1R相結(jié)合的自身抗體可通過模擬血管緊張素Ⅱ的活化從而對排斥反應(yīng)產(chǎn)生影響。

盡管血管緊張素Ⅱ可與AT1R細(xì)胞外環(huán)路及跨膜螺旋的靶點(diǎn)結(jié)合，但AT1R抗體參與移植腎排斥的機(jī)制被認(rèn)為與表達(dá)于AT1R細(xì)胞外第二環(huán)路(the second extracellular loop，ECL2)中的AFJYESQ和ENTNIT抗原表位有關(guān)[11]。針對大鼠的分子動(dòng)力學(xué)研究顯示，ECL2是AT1R 結(jié)構(gòu)的重要組成部分，因而在抗原受體中具有不同的功能狀態(tài)[19]。與血管緊張素Ⅱ結(jié)合狀態(tài)及氯沙坦結(jié)合狀態(tài)激活A(yù)T1R的機(jī)制不同[20]，AT1R抗體可直接作用于ECL2并使抗原受體處于持續(xù)激活狀態(tài)[21]。

如上文提及，腎移植前存在的AT1R抗體是血管性排斥反應(yīng)及惡性高血壓的危險(xiǎn)因素。然而并非所有出現(xiàn)AT1R抗體的腎移植受者都會(huì)出現(xiàn)移植物排斥，意味著可能需要某些輔助因素或環(huán)境條件來促進(jìn)排斥反應(yīng)的發(fā)生。例如，在大鼠缺血再灌注損傷(Ischaemia-reperfusion injury，IRI)模型中，AT1R抗體只有在缺血條件下才能介導(dǎo)腎臟血管收縮。另外，從發(fā)生移植腎血管性排斥的HLA-DSA陰性的受者血清分離出的AT1R抗體可誘導(dǎo)移植腎動(dòng)脈的強(qiáng)烈收縮，但其并不能誘導(dǎo)受者自身動(dòng)脈的收縮[22]。這些研究結(jié)果均支持如下假設(shè)：IRI介導(dǎo)的內(nèi)皮調(diào)節(jié)AT1R表達(dá)和/或AT1R結(jié)構(gòu)的破壞為AT1R與AT1R抗體間的相互作用提供了條件。而有研究發(fā)現(xiàn)IRI可導(dǎo)致一些新抗原的暴露，這些暴露的抗原可成為自然抗體的靶點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了如上假設(shè)[23]。

2 基底膜聚糖

2.1基底膜聚糖在腎移植中的臨床研究 基底膜聚糖是硫酸乙酰肝素蛋白多糖的一種，是血管壁的重要組分。研究發(fā)現(xiàn)，基底膜聚糖的羧基域-血管生成抑制劑，具有抗血管生成特性并含有三個(gè)層黏連蛋白樣區(qū)(Laminin-like globular，LG)[24]。絕大部分抗血管生成劑的抗血管生成活性位于LG3子域。凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞可釋放組織蛋白酶-L，后者可將LG3子域從基底膜聚糖的羧基域中分離出來[25]。有研究發(fā)現(xiàn)腎移植受者血清LG3水平升高與免疫因素介導(dǎo)的血管損傷及移植腎功能不全顯著相關(guān)[26,27]。另有研究發(fā)現(xiàn)，診斷為BanffⅡ級或Ⅲ級的急性血管性排斥的腎移植患者血清LG3水平較BanffⅠ級小管間質(zhì)性排斥或移植腎功能正常患者血清LG3水平顯著升高[27]。

一個(gè)重要的問題是，LG3是否可作為一個(gè)新抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生LG3抗體從而加速排斥反應(yīng)的進(jìn)程。Cardinal等[26]報(bào)道，與未發(fā)生移植腎排斥反應(yīng)的受者相比，發(fā)生急性血管性排斥的腎移植患者術(shù)前和術(shù)后血清LG3抗體IgG1及IgG3亞型水平顯著升高。且移植術(shù)前LG3抗體水平升高可以用來鑒別高風(fēng)險(xiǎn)血管性排斥的受者。單獨(dú)的移植術(shù)前HLA-DSA陽性或移植后LG3抗體水平升高均不能降低發(fā)生血管性排斥的移植物存活率，然而，移植術(shù)前HLA-DSA陽性伴隨移植術(shù)后高水平LG3抗體可顯著降低移植物1年存活率。該結(jié)果提示，與AT1R抗體類似，HLA-DSA和LG3抗體在介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及移植物損傷方面具有協(xié)同作用。

2.2基底膜聚糖的損傷機(jī)制 目前對于基底膜聚糖誘導(dǎo)移植物損傷被認(rèn)為是通過兩個(gè)不同的卻又相互作用的機(jī)制所實(shí)現(xiàn)。其一是基底膜聚糖生物活性改變，促進(jìn)供者血管平滑肌細(xì)胞或受者來源的間充質(zhì)細(xì)胞遷移，從而直接導(dǎo)致血管損傷及新生內(nèi)膜形成。其二為誘導(dǎo)體液性免疫應(yīng)答從而加速免疫因素介導(dǎo)的血管損傷和血管重塑。Hebert的研究為這兩個(gè)機(jī)制提供了證據(jù)。首先他們發(fā)現(xiàn)在小鼠血管性排斥的動(dòng)物模型中，輸注抗LG3的IgG抗體在缺血性移植動(dòng)脈中能夠顯著增加T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的浸潤、C4d的沉積及血管重塑，而在臨近的非缺血性自體動(dòng)脈中卻無上述表現(xiàn)[26]。其次，研究顯示小鼠大動(dòng)脈移植模型中，LG3水平升高可顯著加速血管內(nèi)膜增生[26]。為了進(jìn)一步闡釋LG3如何導(dǎo)致血管重塑，研究者在小鼠大動(dòng)脈移植模型中應(yīng)用了重組LG3。研究發(fā)現(xiàn)，注射LG3可通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶依賴途徑加強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞遷移及內(nèi)膜增生[27]。而且，注射LG3能夠促進(jìn)移植受者來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在新生內(nèi)膜處的聚集，這個(gè)途徑依賴于間充質(zhì)干細(xì)胞中整合蛋白α2β1的表達(dá)。上述發(fā)現(xiàn)均提示，LG3可通過刺激自身抗體表達(dá)和/或促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移導(dǎo)致血管損傷及新生內(nèi)膜形成。

3 自身抗體

器官移植中自身抗體的產(chǎn)生依賴于多種因素。IRI介導(dǎo)的移植物損傷、同種異體免疫及慢性炎癥均可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)于凋亡細(xì)胞表面，從而使這些細(xì)胞作為自身抗原成為可能[28]。在細(xì)胞外囊泡或第三淋巴組織存在的情況下，自身抗原可被移植供者或受者的抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APCs)提呈給自身反應(yīng)性T或B淋巴細(xì)胞。進(jìn)一步了解自身抗體的產(chǎn)生機(jī)制，將有助于研發(fā)新的治療方案用以預(yù)防及控制移植物排斥反應(yīng)和異常血管重塑。

3.1缺血再灌注損傷 器官移植不可避免地經(jīng)歷不同程度的外科創(chuàng)傷、組織破壞及缺血再灌注損傷，而這些損傷均會(huì)促進(jìn)固有炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致對移植物同種異體及自身免疫反應(yīng)。盡管免疫系統(tǒng)環(huán)節(jié)中具有諸多檢查點(diǎn)以保持對自身抗原的中心耐受及外周耐受，但檢查點(diǎn)的缺陷及自身抗原的持續(xù)存在將導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)[29]。IRI是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，包括活性氧的產(chǎn)生、補(bǔ)體活化、凝血、內(nèi)皮細(xì)胞活化和白細(xì)胞招募等過程。IRI引起的組織損傷會(huì)導(dǎo)致急性腎損傷和移植物功能延遲恢復(fù)，并降低移植物存活[30]。IRI引起的凋亡及壞死可導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)分子釋放，包括自身核酸、組蛋白、高遷移率族蛋白B1等。損傷相關(guān)分子可以與模式識別受體相互作用，這些模式識別受體包括表達(dá)于髓性細(xì)胞[30]、樹突狀細(xì)胞[30]、血管內(nèi)皮細(xì)胞[31]及腎小管上皮細(xì)胞[32]表面的Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)及Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)。阻斷TLR可引起髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)的招募及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的釋放，此序貫過程將導(dǎo)致前炎性細(xì)胞因子的釋放，包括IL-1β、IL-6和TNF等，進(jìn)而促進(jìn)獲得性免疫反應(yīng)，加速移植物損傷和自身抗原的暴露[32]。

研究證實(shí)IRI在缺乏同種異體免疫的情況下足以誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)[26]。IRI、自然抗體、HLA-DSA及補(bǔ)體均可破壞血管內(nèi)皮，進(jìn)而導(dǎo)致壞死及凋亡細(xì)胞釋放自身抗原。IRI過程中，從損傷的移植物中釋放的自身抗原諸如波形蛋白、基底膜聚糖及膠原蛋白V可被抗原提呈細(xì)胞加工并提呈給自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞[26,33]。循環(huán)中的B淋巴細(xì)胞與這些自身抗原結(jié)合并被自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞激活進(jìn)而分泌自身反應(yīng)性抗體。此外，在器官移植中，補(bǔ)體激活可促進(jìn)自身反應(yīng)性抗體的產(chǎn)生。

3.2同種異體免疫與自身免疫之間的相互作用 對移植器官或組織產(chǎn)生的同種異體免疫反應(yīng)通過直接、間接及半直接途徑而實(shí)現(xiàn)[34]。一旦這個(gè)過程啟動(dòng)，間接異體反應(yīng)可以擴(kuò)展至初始靶抗原的其他決定簇，這個(gè)過程即分子表位擴(kuò)展[35]。這種同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞通過間接異體識別途徑對供者來源的MHC抗原識別的擴(kuò)展，與慢性排斥反應(yīng)具有相關(guān)性，并與DSA的產(chǎn)生有關(guān)[36]。

與之相似，間接識別途徑可促進(jìn)自身反應(yīng)性T及B淋巴細(xì)胞的發(fā)展并對移植物排斥產(chǎn)生作用[37]。器官移植后間接異體免疫反應(yīng)觸發(fā)自身免疫可能通過抗原模擬自身抗原多肽及供者M(jìn)HC多肽而實(shí)現(xiàn)[38]。異體免疫反應(yīng)后會(huì)出現(xiàn)克隆增殖的T淋巴細(xì)胞，一旦這些細(xì)胞被激活，將誘導(dǎo)出現(xiàn)移植物的同種異體排斥反應(yīng)[39]。另一種可能是，針對供者HLA抗原的異體免疫反應(yīng)引起的組織破壞，可以導(dǎo)致隱蔽自身抗原的釋放，促進(jìn)自身隱蔽抗原決定簇的抗原提呈，從而在移植物組織內(nèi)誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。

3.3細(xì)胞外囊泡 通過胞外囊泡建立的細(xì)胞間的相互聯(lián)系逐漸被認(rèn)為是引起自身免疫及異體免疫的機(jī)制[40]。由于胞外囊泡來源于細(xì)胞，因此其包含mRNA、miRNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物等，并能夠正向及負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[40]。根據(jù)來源不同，胞外囊泡可分為三大類：外泌體、細(xì)胞膜微粒及凋亡小體，所有胞外囊泡均含有大量自身抗原?？乖岢始?xì)胞釋放的胞外小體也攜帶表面MHCⅠ類及Ⅱ類分子，并能激活T淋巴細(xì)胞[41,42]。盡管高濃度的外泌體可以直接激活T淋巴細(xì)胞，但由于缺乏共刺激分子，外泌體的抗原提呈效率較專業(yè)的抗原提呈細(xì)胞低得多。相反，當(dāng)外泌體與樹突狀細(xì)胞相互作用時(shí)，可高效地激活T淋巴細(xì)胞[41]。

3.4TH17細(xì)胞及第三淋巴組織 TH17細(xì)胞是分泌IL-17的主要細(xì)胞，并參與多種自身免疫性疾病[43]。被TGF-β 和 IL-6所激活的TH17細(xì)胞可強(qiáng)有力地誘導(dǎo)白細(xì)胞招募及介導(dǎo)對外源性病原體的免疫反應(yīng)，然而被IL-23所激活的TH17細(xì)胞能夠加速組織炎癥及自身免疫反應(yīng)。

有研究報(bào)道，移植腎慢性排斥反應(yīng)過程中第三淋巴組織(Tertiary lymphoid tissue，TLT)的出現(xiàn)[44]。TLT通過淋巴組織新生過程出現(xiàn)于慢性炎癥反應(yīng)中。在某些自身免疫性疾病中，TLT能夠支持自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞的增殖及成熟[45]。Hsu等[46]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠自身免疫性疾病模型中，TH17通過分泌IL-17促進(jìn)自身反應(yīng)性生發(fā)中心的有序形成。與此類似，將TH17細(xì)胞輸注給T淋巴細(xì)胞缺陷的小鼠，將誘導(dǎo)向自身免疫反應(yīng)方向的優(yōu)先類型轉(zhuǎn)換及生發(fā)中心的形成，而類型轉(zhuǎn)換依賴于TH17細(xì)胞分泌的IL-21[43]。

鑒于TH17細(xì)胞具有高水平克隆增殖特性，與TH1細(xì)胞相比，其對同源B淋巴細(xì)胞具有更強(qiáng)的輔助功能。聯(lián)合B淋巴細(xì)胞囊泡和誘導(dǎo)型T細(xì)胞輔助刺激因子的表達(dá)，這個(gè)過程對于T細(xì)胞依賴性抗體的產(chǎn)生至關(guān)重要。由于持續(xù)分泌BAFF和IL-21，可促進(jìn)B細(xì)胞的存活，因此自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞在第三淋巴組織中可逃脫過凋亡指令和陰性選擇[47]。而且在促炎因子存在的條件下，組織損傷所釋放的新抗原可被缺陷的淋巴引流系統(tǒng)捕獲，并可不斷支持第三淋巴組織的形成[48]。以上研究結(jié)果說明TH17細(xì)胞對于B淋巴細(xì)胞分化及抗體產(chǎn)生具有重要意義。

4 結(jié)論及展望

自身免疫在實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。自身抗體的產(chǎn)生可能通過多種機(jī)制而實(shí)現(xiàn)。至今對于非HLA抗體引起的免疫致敏臨床上尚無公認(rèn)的脫敏療法。對于自身抗體導(dǎo)致的AMR的治療策略與HLA抗體導(dǎo)致的AMR的治療類似，包括抗體清除[49]、B細(xì)胞清除[50]、靜脈注射免疫球蛋白[51]、蛋白酶體抑制劑[52]及補(bǔ)體抑制劑[53]。然而這些療法單獨(dú)使用還是聯(lián)合使用效果更佳尚不清楚。未來需要更多的研究來闡明自身抗體的致病機(jī)制以及探索更有效的治療方案。在一項(xiàng)針對去抗體治療抵抗的前期研究中，發(fā)現(xiàn)IL-6抑制劑塔西單抗對于HLA-DSA的治療具有潛在價(jià)值[54]。針對IL-17通路、mi RNA和外泌體調(diào)節(jié)[55]方面的治療方法有望成為逆轉(zhuǎn)自身抗體介導(dǎo)的AMR及改善移植物存活的有效策略。

由于我們對器官移植中自身抗原如何引起免疫反應(yīng)的機(jī)制知之甚少，限制了我們對抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)的診斷及治療?，F(xiàn)代基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)為檢測抗體譜提供了新工具[56]，不斷發(fā)現(xiàn)的新靶點(diǎn)有助于了解自身抗體的致病機(jī)制，并為提高移植物的長期存活提供有效策略。