伊洛前列素對ILC2s介導(dǎo)的小鼠急性過敏性氣道炎癥的作用研究①

李倩陽 楊 柳 趙坤宇 李智濤 蔣莉莉 李付廣

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，洛陽 471023)

過敏性哮喘是一種由肺部過敏性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性、黏液分泌過多和氣道重塑為特征的復(fù)雜的呼吸道異質(zhì)性疾病。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，過敏性炎癥主要是由輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)功能失調(diào)，抗原特異性的Th2細(xì)胞過度活化，并分泌大量的Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)所導(dǎo)致的[1]。但Oboki等[2]研究發(fā)現(xiàn)，T/B細(xì)胞缺陷小鼠吸入木瓜蛋白酶或重組IL-33也可誘導(dǎo)肺部炎癥，這表明除了T細(xì)胞之外，還有某種免疫細(xì)胞，能在早期產(chǎn)生2型細(xì)胞因子，且該細(xì)胞在過敏性炎癥的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，與Th2細(xì)胞有“鏡像細(xì)胞”之稱的2型固有淋巴細(xì)胞(Group 2 innate lymphoid cells,ILC2s)可通過分泌大量的IL-5、IL-13直接或間接誘導(dǎo)2型免疫反應(yīng)[3]。

ILC2s最初在腸道相關(guān)的黏膜組織中被發(fā)現(xiàn)，其生長發(fā)育需要轉(zhuǎn)錄因子GATA3和RORα，此外，ILC2s表面也表達(dá)IL-33受體(ST2)及IL-25受體(IL-17RB)，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過敏原刺激機體時，受損的氣道上皮細(xì)胞會分泌IL-33、IL-25、胸腺基質(zhì)淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)，其中IL-33屬于IL-1家族成員，在上皮細(xì)胞損傷或壞死時，它作為最重要的“警報素”直接與ST2結(jié)合[4]，刺激ILC2s活化增殖并分泌大量的2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)，從而在早期參與過敏性氣道炎癥反應(yīng)，因此IL-33-ILC2-IL-5/IL-13軸被認(rèn)為是在過敏原誘導(dǎo)的急性過敏性氣道炎癥中極為重要的通路[5]。

前列環(huán)素(Prostaglandin I2,PGI2)是花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧合酶(COX)途徑的代謝產(chǎn)物，在肺部的來源是血管內(nèi)皮細(xì)胞，主要通過G蛋白偶聯(lián)受體IP(Prostaglandin I receptor)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。伊洛前列素(Iloprost)是PGI2類似物，臨床上多用于治療肺動脈高壓[6]。有研究報道，抑制COX可以增強過敏性炎癥以及肺部CD4+Th2細(xì)胞表達(dá)2型細(xì)胞因子，這表明COX產(chǎn)物能夠抑制過敏原誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[7]。還有研究報道，伊洛前列素能夠以劑量依賴的方式抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子，從而調(diào)控2型免疫應(yīng)答[8]，由此我們猜測，伊洛前列素是否對ILC2s也存在抑制作用。

本實驗使用IL-33作為刺激劑，建立小鼠急性過敏性氣道炎癥模型，并使用伊洛前列素進(jìn)行干預(yù)，通過檢測小鼠肺組織以及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中ILC2s的數(shù)量變化以及2型細(xì)胞因子IL-5、IL-13的水平變化，來探究伊洛前列素對小鼠急性過敏性氣道炎癥中ILC2s的抑制作用，為急性過敏性氣道炎癥的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1動物及試劑 SPF級C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房內(nèi)。重組小鼠IL-33(R&D公司)；伊洛前列素(Cayman Chemical公司)；抗小鼠Ly-6A/E(Sca-1)-FITC mAb，抗小鼠KLRG-1-PE mAb，抗小鼠Siglec-F-PE mAb(BD公司)；Lineage Cell Depletion Kit，抗生物素-APC(德國美天旎公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)；細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物)；TRIzol，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green熒光試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2方法

1.2.1分組及造模 采用隨機原則將24只雌性C57BL/6小鼠分為4組，即為DMSO對照組、IL-33刺激組、IL-33+iloprost干預(yù)組和單獨iloprost組，每組6只，在SPF級動物房內(nèi)適應(yīng)一周，于第1、2、3天滴鼻刺激，每次滴鼻液體積均為40 μl，第5天處死小鼠，并收集支氣管肺泡灌洗液。IL-33刺激組：每只給予IL-33 0.5 μg/次；iloprost對照組：每只給予iloprost 2.5 μg/次(2.5 μg iloprost需0.675 μl DMSO助溶)；IL-33+iloprost干預(yù)組：每只給予iloprost 2.5μg/次，在滴入iloprost 30 min后再滴入IL-33，IL-33需0.5 μg/次；DMSO對照組：每只給予0.675 μl DMSO，再加入PBS至終體積為40 μl。

1.2.2收集BALF 處死小鼠，充分暴露氣管，用注射器針頭經(jīng)環(huán)狀軟骨進(jìn)行氣管插管，抽取0.8 ml PBS，緩緩注入氣管，停留約30 s后慢慢回抽，重復(fù)灌洗3次，最后回抽出0.7 ml左右灌洗液。重復(fù)3次后，將收集到的BALF 1 500 r/min離心10 min，沉淀細(xì)胞用做流式分析，上清凍存于-80℃待檢。

1.2.3制備肺組織勻漿上清 取小鼠右肺副葉，每100 mg肺組織加入1 ml PBS，使用美天旎的溫和組織勻漿處理器制備肺組織勻漿，之后將肺組織勻漿7 500 r/min離心10 min后取上清，并將上清分裝凍存于-20℃待檢。

1.2.4制備肺組織切片 取小鼠左肺葉，用生理鹽水沖洗干凈，并置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋、組織切片后，按試劑盒要求進(jìn)一步脫蠟，行HE染色和PAS染色，觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗 按照相關(guān)說明書進(jìn)行操作。

1.2.6制備肺單細(xì)胞懸液及流式細(xì)胞術(shù) 把處理干凈的右肺上、中葉放置于40 μm的尼龍濾器中，尼龍濾器置于含有7 ml RPMI1640培養(yǎng)液(其中含7 μl濃度為1 μg/μl 的DNaseⅠ和70 μl 濃度為5 μg/μl 的Liberase TM)的6孔板中，用無菌剪刀將肺剪成長度為2 mm左右的小段，37℃孵育45 min，用1 ml注射器平端手工研磨，邊研磨邊用8 ml含5%FBS的Hank′s液沖洗，收集肺單細(xì)胞懸液，離心棄上清。用Percoll分離液分離淋巴細(xì)胞層，并用FAC Buffer洗滌，離心，棄上清，用含5%FBS的Hank′s液重懸沉淀，并將細(xì)胞濃度調(diào)整到1.0×106個/ml，每管加1 μl FcR阻斷劑，冰上孵育5 min后加相應(yīng)的抗體，采用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.7Real time-PCR 取出液氮中凍存的右肺下葉，按每100 mg組織加入1 ml Trizol的比例加入適量Trizol裂解，提取總RNA，用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以小鼠GAPDH為內(nèi)參基因，使用PrimerBank設(shè)計引物，引物序列見表1，通過SYBR?Green real-time PCR檢測IL-5、IL-13、GATA3、ST2 mRNA的表達(dá)。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1小鼠肺組織HE和PAS染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，DMSO對照組和單獨iloprost組小鼠支氣管肺泡呈正常的形態(tài)，周圍無炎性細(xì)胞浸潤和充血水腫，而IL-33刺激組小鼠肺組織可見明顯的炎癥性改變，細(xì)支氣管及血管周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤，多伴有嗜酸性粒細(xì)胞聚集，且肺泡壁增厚；與刺激組相比，使用iloprost干預(yù)后，肺組織的氣管和血管周圍仍有炎性細(xì)胞浸潤，但程度明顯減輕(圖1)。PAS染色結(jié)果顯示，DMSO對照組和單獨iloprost組小鼠氣道黏膜處未見杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌，而IL-33刺激組小鼠氣道黏膜處杯狀細(xì)胞增生明顯，且黏液分泌增多；與刺激組相比，使用iloprost干預(yù)后，氣道黏膜上皮細(xì)胞雖有增生，但黏液分泌明顯減少(圖1)。

表1Real-timePCR擴(kuò)增引物

Tab.1Primersequencesusedforreal-timePCR

PrimersSequencesIL-5Forward:5'-CTCTGTTGACAAGCAATGAGACG-3'Reverse:5'-TCTTCAGTATGTCTAGCCCCTG-3'IL-13Forward:5'-CCTGGCTCTTGCTTGCCTT-3'Reverse:5'-GGTCTTGTGTGATGTTGCTCA-3'GATA3Forward:5'-CTCGGCCATTCGTACATGGAA-3'Reverse:5'-GGATACCTCTGCACCGTAGC-3'ST2Forward:5'-TGACACCTTACAAAACCCGGA-3'Reverse:5'-AGGTCTCTCCCATAAATGCACA-3'mGAPDHForward:5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'Reverse:5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'

2.2ELISA檢測小鼠BALF中IL-5、IL-13水平 ELISA結(jié)果顯示，IL-33刺激組小鼠BALF中IL-5、IL-13含量較DMSO組和單獨iloprost組均顯著增高(P<0.05)，使用iloprost干預(yù)后，小鼠BALF中IL-5、IL-13含量較IL-33刺激組有明顯降低(P<0.05)(圖2)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠BALF和肺單細(xì)胞懸液中嗜酸性粒細(xì)胞及ILC2s的結(jié)果 流式結(jié)果顯示，IL-33刺激組小鼠BALF和肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞，以及肺組織中的ILC2s占總上樣細(xì)胞數(shù)的比例和絕對值均顯著高于DMSO對照組和單獨iloprost組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；使用iloprost干預(yù)后，小鼠BALF及肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞，以及肺組織中的ILC2s占總上樣細(xì)胞數(shù)的比例和絕對值均低于IL-33刺激組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示使用IL-33刺激可以誘導(dǎo)小鼠急性過敏性氣道炎癥；而iloprost可能會對IL-33誘導(dǎo)所引起的嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤以及ILC2s的活化增殖產(chǎn)生抑制作用(圖3)。

圖1 小鼠肺組織病理學(xué)改變Fig.1 Pathological changes in mouse lung tissues

圖2 小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-5、IL-13的濃度變化Fig.2 Changes in levels of IL-5 and IL-13 in mouse BALFNote:Data shown are representative of six independent experiments.

圖3 小鼠BALF及肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞和ILC2s含量的變化Fig.3 Changes in numbers of eosinophils and ILC2s in mouse BALF and lung tissuesNote:Data shown are representative of six independent experiments.

圖4 小鼠肺組織中IL-5、IL-13、GATA3、ST2 mRNA表達(dá)量變化Fig.4 Changes in expression of IL-5，IL-13，GATA3 and ST2 at mRNA level in mouse lung tissuesNote:Data shown are representative of six independent experiments.

2.4Real-time PCR檢測小鼠肺組織中IL-5、IL-13、GATA3、ST2的mRNA表達(dá)量 Real-time PCR結(jié)果顯示，IL-33刺激組小鼠肺組織中IL-5、IL-13、GATA3、ST2的mRNA相對表達(dá)量均高于DMSO組和單獨iloprost組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；使用iloprost干預(yù)后，小鼠肺組織中IL-5、IL-13、GATA3、ST2的mRNA相對表達(dá)量均低于IL-33刺激組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

3 討論

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，過敏性哮喘主要是由抗原特異性的Th2細(xì)胞及2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)介導(dǎo)的免疫失調(diào)性疾病，然而，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，ILC2s能參與早期過敏性氣道炎癥反應(yīng)。

與Th2細(xì)胞類似，ILC2s受轉(zhuǎn)錄因子GATA3調(diào)控，也可產(chǎn)生2型細(xì)胞因子；與T細(xì)胞、B細(xì)胞等淋巴細(xì)胞不同，ILC2s不表達(dá)傳統(tǒng)的淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記如TCR、BCR等，但表達(dá)KLRG-1、Sca-1、ICOS以及多種細(xì)胞因子受體如CD25(IL-2R)、CD127(IL-7R)、ST2(IL-33R)和TSLPR[9]。有文獻(xiàn)報道，IL-33-ST2軸對過敏性氣道炎癥的發(fā)生極其重要，它能夠啟動固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生大量的2型細(xì)胞因子[10]。因此本實驗主要采用IL-33滴鼻法建立急性過敏性氣道炎癥模型，通過檢測GATA3、ST2及2型細(xì)胞因子(IL-5、IL-13)的表達(dá)水平來反映ILC2s的功能變化。

在過敏性氣道炎癥反應(yīng)的早期，機體主要以固有免疫應(yīng)答為主。Bartemes等[11]研究顯示，哮喘患者的外周血及肺組織中，ILC2s的數(shù)目明顯增多；動物研究證實，單獨ILC2s所分泌的IL-13足以在小鼠體內(nèi)引起較明顯的過敏性氣道炎性改變[12]。在本實驗中，IL-33模型組小鼠BALF中2型細(xì)胞因子(IL-5、IL-13)水平和肺組織中ILC2s的數(shù)量均明顯高于DMSO對照組和單獨iloprost組，這提示ILC2s可能是小鼠急性過敏性氣道炎癥中2型細(xì)胞因子的重要來源。有研究報道，ILC2s還可通過其表面分子ICOS、ICOS配體(ICOS-L)和MHCⅡ類分子的相互作用，引起ILC2與Th2細(xì)胞之間的相互對話[13]，且活化的Th2細(xì)胞又可以分泌IL-2，進(jìn)一步促進(jìn)ILC2s增殖和IL-13的產(chǎn)生。由此可見，過敏性氣道炎癥是固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答共同作用的結(jié)果，但I(xiàn)LC2s作為固有免疫細(xì)胞，主要在早期參與急性過敏性氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

近期研究發(fā)現(xiàn)，許多非細(xì)胞因子的脂類介質(zhì)(尤其是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物)可參與調(diào)節(jié)ILC2s的功能。Dorethy等[14]研究顯示，白三烯D4(LTD4)可誘導(dǎo)ILC2s增殖，產(chǎn)生2型細(xì)胞因子進(jìn)而促進(jìn)肺部炎癥；Xue等[15]發(fā)現(xiàn)，PGD2，主要由肥大細(xì)胞產(chǎn)生的前列腺素，能促進(jìn)人類ILC2s產(chǎn)生IL-13，還能協(xié)同增強ILC2s在上皮源性細(xì)胞因子IL-33、IL-25的作用下產(chǎn)生2型細(xì)胞因子的能力；最近也有報道稱，花生四烯酸的終末代謝產(chǎn)物PGI2及其類似物可以在一定程度上抑制過敏性肺部炎癥。

PGI2，主要通過G蛋白偶聯(lián)受體IP發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，伊洛前列素(iloprost)作為PGI2的類似物，由于其具有抗血小板凝集和強有力的擴(kuò)張血管作用，臨床上多用于治療肺動脈高壓。研究發(fā)現(xiàn)，PGI2及其類似物在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，iloprost能夠在Th2極化條件下抑制CD4+T細(xì)胞活化以及2型細(xì)胞因子IL-5、IL-13的分泌[8]，還能通過增加共刺激分子CD86的表達(dá)進(jìn)而影響B(tài)細(xì)胞的功能。此外，PGI2及其類似物還能影響固有免疫應(yīng)答，它不僅能夠抑制嗜酸性粒細(xì)胞的趨化和遷移，還能以IP受體依賴的方式較明顯地抑制LPS誘導(dǎo)的DCs表達(dá)促炎因子、趨化因子和MHCⅡ類分子。鑒于ILC2s是Th2細(xì)胞的“鏡像細(xì)胞”，我們考慮PGI2類似物是否也會對固有免疫反應(yīng)中的ILC2s產(chǎn)生抑制作用。在本實驗中，通過IL-33滴鼻法建立小鼠急性過敏性肺部炎癥模型，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測BALF和肺組織中EOS和ILC2s的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用iloprost干預(yù)后，BALF及肺組織中EOS和ILC2s的數(shù)量均明顯低于IL-33刺激組；real-Time PCR檢測，IL-33+iloprost干預(yù)組IL-5、IL-13、GATA3及ST2的mRNA相對表達(dá)量均低于IL-33刺激組；ELISA結(jié)果顯示，IL-33+iloprost干預(yù)組中，小鼠BALF中IL-5、IL-13含量低于IL-33刺激組。由前期實驗結(jié)果初步推測，iloprost可能會抑制ILC2s介導(dǎo)的小鼠急性過敏性炎癥反應(yīng)。

綜上所述，iloprost可能通過抑制ILC2s的功能，進(jìn)而抑制由IL-33誘導(dǎo)的小鼠急性過敏性氣道炎癥，因此，本實驗為過敏性炎癥疾病的治療提供新的思路。但是，過敏性氣道炎癥的發(fā)生是多因素相互調(diào)控的過程，關(guān)于iloprost影響過敏性氣道炎癥的具體分子機制還有待進(jìn)一步探討。