COX—2活化PI3K/Akt信號通路促結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的實驗研究

閆康鵬　江長安　吳昆

【摘要】 目的：探討COX-2促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移效果及其機制，從而為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移防治提供依據(jù)。方法：建立COX-2低表達和高表達CT26結(jié)腸癌細胞株，通過注射0.2 mL的對數(shù)生長期細胞濃度為1×106 個/mL的正常CT26結(jié)腸癌細胞懸液（A組，n=20）、COX-2高表達的CT26結(jié)腸癌細胞懸液（B組，n=20）以及COX-2低表達的結(jié)腸癌細胞懸液（C組，n=20）至脾臟制作小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，檢測比較三組小鼠移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt表達、移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量以及生存期，并分析結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠COX-2、PI3K、p-Akt表達的相互關(guān)系以及三者與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量以及生存期的關(guān)系。結(jié)果：與A組比較，B組和C組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率均升高，移植瘤體積降低，肝臟腫瘤大小和數(shù)量降低，生存期延長（P<0.05）。與B組比較，C組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率均升高，移植瘤體積降低，肝臟腫瘤大小和數(shù)量降低，生存期延長（P<0.05）。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠移植瘤COX-2蛋白表達與其PI3K、p-Akt蛋白表達呈正相關(guān)（P<0.05），且其移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量均呈正相關(guān)（P<0.05），與其生存期均呈負相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：COX-2可促結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和影響其預(yù)后，在此過程中可能涉及其活化PI3K/Akt信號通路作用。

【關(guān)鍵詞】 COX-2； 活化； PI3K； Akt； 信號通路； 結(jié)直腸癌； 肝轉(zhuǎn)移

Experimental Study on COX-2 Promoting Liver Metastasis of Rectal Cancer by Activating PI3K/Akt Signaling Pathway/YAN Kangpeng，JIANG Changan，WU Kun.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：001-005

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of COX-2 on the liver metastasis of colorectal cancer and its mechanism，so as to provide the basis for prevention and treatment of liver metastasis of colorectal cancer.Method：COX-2 low expression and high expression CT26 colon cancer cell line were established，and mouse colon cancer liver metastasis model was established by injecting 0.2 mL of 1×106/mL cell concentration logarithmic growth phase normal CT26 colon cancer cell suspension（group A，n=20），COX-2 high expression colorectal cancer cell suspension（group B，n=20） and COX-2 low expression colorectal cancer cell suspension（group C，n=20） into spleen.The expression of COX-2，PI3K，p-Akt，the volume of transplanted tumor，the size and number of liver tumor and the survival time of three groups were analyzed and compared.The relationship between COX-2 expression with PI3K，p-Akt expression，the volume of transplanted tumor，the size and number of liver tumors and the survival time were analyzed.Result：Compared with group A，COX-2，PI3K and p-Akt positive protein expression rate of group B and group C were increased，the volume of transplanted tumor of group B and group C were decreased，the size and number of liver tumor of group B and group C were decreased，and the survival time of group B and group C were prolonged（P<0.05）.Compared with group B，COX-2，PI3K and p-Akt positive protein expression rate of group C were increased，the volume of transplanted tumor of group C were decreased，the size and number of liver tumor of group C were decreased，and the survival time of group C was prolonged（P<0.05）.Spearman correlation analysis showed that COX-2 protein expression was positively correlated with PI3K and p-Akt protein expression in colorectal cancer liver transplanted mice（P<0.05）.The expression of COX-2，PI3K and p-Akt were positively correlated with the tumor volume， the size and number of liver tumors（P<0.05），and negatively correlated with the survival time（P<0.05）.Conclusion：COX-2 can promote the liver metastasis of colorectal cancer and affect its prognosis.In this process，it may be involved in the activation of PI3K/Akt signaling pathway.endprint

【Key words】 COX-2； Activation； PI3K； Akt； Signaling pathway； Colorectal cancer； Liver metastasis

First-authors address：Jiangxi Provincial Cancer Hospital，Nanchang 330029，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.001

結(jié)直腸癌為臨床常見惡性腫瘤，?？砂l(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移而加重其治療困難程度，影響預(yù)后[1-2]，因此，對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移進行有效的防治具有重要性和緊迫性。結(jié)直腸癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展涉及多個機制，其中環(huán)氧酶-2（COX-2）、PI3K-Akt信號通路等均為癌癥密切相關(guān)基因[3-4]。然而目前關(guān)于COX-2、

PI3K-Akt信號通路在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用及其相互關(guān)系研究甚少。因此，本研究制作了不同COX-2表達情況的小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，檢測比較了其PI3K-Akt信號通路表達、病情和預(yù)后等情況，并分析了其相互關(guān)系，旨在為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的防治提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 小鼠結(jié)腸腺癌CT26細胞株均購自上海麥莎生物有限公司。小鼠為SPF級的BALB/C小鼠，均為雄性，年齡6～8周，中位年齡48 d，體重15～23 g，中位體重19 g，均購自復(fù)旦大學(xué)實驗動物部，獨立飼養(yǎng)，自由攝食攝水。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要儀器和試劑 恒溫箱（江蘇佳美儀器有限公司），胰蛋白酶（美國Sigma 公司），玻璃瓶、吸管、試管、注射器等（廣東東普醫(yī)療科技有限公司），RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司），顯微鏡（日本Nikon公司），COX-2 RNA干擾靶序列（蘇州泓迅生物科技股份有限公司），真核表達載體（上海捷蘭生物技術(shù)有限公司），RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），實時定量PCR試劑盒和SYBR Premix EX Taq（日本Takara公司），單克隆鼠抗人COX-2試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），單克隆鼠抗人PI3K試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），單克隆鼠抗人p-Akt試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），COX-2二抗試劑盒（美國Sigma公司），PI3K二抗試劑盒（美國Sigma公司），p-Akt二抗試劑盒（美國Sigma公司）。

1.2.2 建立COX-2低表達和高表達CT26結(jié)腸癌細胞株 建立COX-2低表達CT26結(jié)腸癌細胞株：設(shè)計靶向COX-2基因RNA干擾序列，并利用真核表達載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染CT26結(jié)腸癌細胞篩選陽性克隆，經(jīng)傳代10次以上，RT-PCR檢查確定結(jié)腸癌細胞株COX-2表達，建立COX-2低表達結(jié)腸癌細胞株（≤COX-2正常表達的50%）。

建立COX-2高表達CT26結(jié)腸癌細胞株：克隆野生型COX-2全長基因，構(gòu)建COX-2真核細胞表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)入CT26結(jié)直腸癌細胞株，篩選陽性克隆，經(jīng)傳代10次以上，RT-PCR檢查確定結(jié)腸癌細胞株COX-2表達，建立高表達結(jié)腸癌細胞株（≥COX-2正常表達的200%）。

1.2.3 小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立 取對數(shù)生長期COX-2低表達、正常表達和高表達CT26結(jié)腸癌細胞，添加胰消化酶消化后采用RPMI-1640制成細胞懸液，細胞濃度調(diào)節(jié)為1×106個/mL。小鼠腹部皮膚酒精消毒后通過注射器將0.2 mL的對數(shù)生長期細胞濃度為1×106個/mL的正常CT26結(jié)腸癌細胞懸液（A組，n=20）、COX-2高表達的CT26結(jié)腸癌細胞懸液（B組，n=20）以及COX-2低表達的結(jié)腸癌細胞懸液（C組，n=20）注射至小鼠脾臟上緣，制作小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。

1.2.4 相關(guān)指標檢測觀察 小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型制備后每3天進行一次小鼠體重檢查、超聲移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量檢查等，以末次檢查結(jié)果為最終結(jié)果，并觀察其自然生存期。三組小鼠死亡后均剖腹切取移植瘤進行COX-2、PI3K、p-Akt表達的檢測，將獲得的標本常規(guī)制成石蠟包塊，切成4 μm厚連續(xù)石蠟切片，檢測前常規(guī)行二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后高壓抗原修復(fù)3次，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性生物素和過氧化物酶后添加正常山羊血清封閉孵育，添加即用型COX-2、PI3K、p-Akt單克隆抗體后孵育過夜，添加COX-2、PI3K、p-Akt二抗后室溫孵育，行DAB顯色，顯色滿意后行蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察，顯微鏡下隨機選取5個視野進行觀察，以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達，統(tǒng)計各基因陽性表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件包，計數(shù)資料比較采用 字2檢驗，多組計量資料比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用q檢驗，采用Spearman相關(guān)分析法分析結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠COX-2、PI3K、p-Akt表達的相互關(guān)系以及三者與其移植瘤體積肝臟腫瘤大小和數(shù)量以及生存期的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率比較 與A組比較，B組和C組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與B組比較，C組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1和圖1～3。

2.2 三組病情和預(yù)后比較 與A組比較，B組和C組移植瘤體積降低，肝臟腫瘤大小和數(shù)量降低，生存期延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與B組比較，C組移植瘤體積降低，肝臟腫瘤大小和數(shù)量降低，生存期延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。endprint

2.3 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠COX-2、PI3K、p-Akt表達的相互關(guān)系以及三者與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量以及生存期的關(guān)系分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠移植瘤COX-2蛋白表達與其PI3K、p-Akt蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.892、0.883，P<0.05），且其移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量均呈正相關(guān)（COX-2：r=0.879、0.825、0.878，PI3K：r=0.821、0.848、0.828，p-Akt：r=0.808、0.852、0.816，P<0.05），與其生存期均呈負相關(guān)（r=-0.835、-0.812、-0.827，P<0.05）。

3 討論

近年來隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，各類消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生亦不斷增加。結(jié)直腸癌是臨床常見消化系統(tǒng)惡性病變，可發(fā)生于結(jié)直腸的任意部位，近年來其發(fā)病不斷增加，已成為嚴重困擾人類健康和威脅患者生命安全的重要病癥[5-7]。且結(jié)直腸癌可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，在其遠處轉(zhuǎn)移中肝轉(zhuǎn)移是最為常見轉(zhuǎn)移臟器，其肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生可進一步加重病情和治療困難程度，嚴重威脅患者健康和生存[8-10]。本研究結(jié)直腸癌小鼠模型均可進一步出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，且其肝臟轉(zhuǎn)移瘤書庫較多，體積較大，可影響病情和療效，甚至影響生存期。因此，結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移發(fā)生率，對病情和預(yù)后影響大，明確其發(fā)生發(fā)展機制對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的防治均具有重要的指導(dǎo)意義。

結(jié)直腸癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展涉及多個機制，而其肝轉(zhuǎn)移等遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生確切機制不明。已有研究證實，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生涉及多個癌癥相關(guān)基因表達異常[11-12]。在癌癥相關(guān)基因中，COX-2是常見的促癌基因，而選擇性地進行COX-2表達抑制有利于促進癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[13-14]。因此，COX-2亦可能促進結(jié)直腸癌細胞遷移，導(dǎo)致肝轉(zhuǎn)移等遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。PI3K-Akt信號通路在人類大多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用，可通過促進癌癥細胞的增殖和存活并抑制癌癥細胞的凋亡而促進癌癥發(fā)生發(fā)展[15-16]。亦有多個研究證實了PI3K-Akt信號通路在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中具有重要作用[17-18]。因此，PI3K-Akt信號通路激活可能為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的重要機制，而COX-2則可能協(xié)同或調(diào)控PI3K-Akt信號通路從而影響結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，然而目前此方面研究甚少，需進一步研究證實[19-20]。

本研究制作了COX-2低表達、COX-2正常表達和COX-2高表達結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型，并對其PI3K-Akt信號通路情況進行了分析，結(jié)果顯示，COX-2表達率較高組的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物中PI3K-Akt信號通路表達亦越高，提示COX-2表達可能與PI3K-Akt信號通路相關(guān)。而進一步的Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠移植瘤COX-2蛋白表達與其PI3K、p-Akt蛋白表達呈正相關(guān)，且其移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量均呈正相關(guān)，與其生存期均呈負相關(guān)。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中COX-2、PI3K-Akt信號通路均具有促進作用，而PI3K-Akt信號通路的激活情況與COX-2表達情況一致，由此可推論COX-2可能通過PI3K-Akt信號通路的激活而促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展，而抑制COX-2和PI3K-Akt信號通路表達可能為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移防治的重要途徑，此方面尚需更深入研究證實。

綜上所述，COX-2可能通過PI3K/Akt信號通路激活促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和影響預(yù)后，COX-2和PI3K-Akt信號通路均可能為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移防治的重要靶點。

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（收稿日期：2017-09-15） （本文編輯：程旭然）endprint