miR-124靶向抑制NFATc1調控小鼠C3H10T1/2細胞軟骨分化的研究

靳松 黃愛軍 林昆 彭建強 李亞杰 鄒學農

骨髓間充質干細胞(MSC)是一類來源于骨髓的具有多向分化潛能的干細胞，具有自我更新、組織再生和抗炎修復等功能。研究表明，MSC經誘導分化后性別決定區(qū)Y框蛋白9(Sox9)、Ⅱ型膠原及缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達水平上調，提示其具有轉化為類髓核細胞的潛能[1]。MSC移植修復椎間盤退變疾病的重要機制是，在椎間盤微環(huán)境中MSC向類髓核細胞分化并增加基質大分子的合成。MSC來源廣泛、體外培養(yǎng)可誘導類髓核細胞分化，是一種非常有前景的可應用于臨床治療椎間盤退變疾病的種子細胞。微小RNA(miR)是一類含有18～24個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)的互補序列以堿基配對方式執(zhí)行降解靶基因或抑制其翻譯的功能，參與調控MSC分化過程中的多種生物學過程[2-4]。本研究通過在線軟件預測miR-124的靶基因，發(fā)現活化T細胞核因子c1(NFATc1)是其中一個潛在靶點。NFAT家族是一類具有廣泛生理功能的轉錄因子，在成軟骨分化過程中，NFATc1能促進軟骨基因表達[5]。NFATc1廣泛參與MSC生長、分化的生物學過程，特別是在成軟骨過程中有基因調控的功能[6]。由此推測，miR-124可能通過靶向調控NFATc1表達促進人MSC向軟骨細胞分化。本研究采用成軟骨分化誘導培養(yǎng)體系誘導C3H10T1/2細胞向成軟骨細胞分化，并探究miR-124在此過程是否通過調控NFATc1靶基因發(fā)揮生物學作用。

材料與方法

一、主要材料

間充質干細胞株C3H10T1/2細胞系(中山大學骨科研究所提供)；高糖型DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清購自美國HyClone公司；谷氨酰胺購自美國Gibco公司；胰酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、抗壞血酸、青霉素鏈霉素雙抗、β-甘油磷酸鈉、地塞米松購自美國Sigma公司； pmiR-RB-REPORTTM質粒載體、ribo FECTTMCP轉染試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒及Trizol購于美國Invitrogen公司。Spe I、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶和SYBR Premix ExTaqTM定量PCR試劑均為大連寶生物公司產品。實時定量PCR miR檢測試劑盒購自廣州天根生物公司。miR-124模擬物(mimics)及抑制物(inhibitors)為美國Ambion公司產品。定點突變試劑盒購自美國Stratagene公司。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司。Smad4抗體和GAPDH抗體購自美國CST公司。NFATc1小干擾RNA(siRNA)由美國Invitorgen公司合成，引物合成及測序由深圳達生生物科技公司完成。

二、方 法

1.細胞培養(yǎng)與軟骨誘導分化

以離心法進行軟骨微團的構建，具體操作步驟參照文獻[7]進行。小鼠C3H10T1/2細胞株經復蘇后室溫離心收集沉淀，用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液混懸于37℃、5%CO2靜置培養(yǎng)，待細胞融合至80%～90%，在胰酶消化下進行傳代，每3 d更換培養(yǎng)液1次。將培養(yǎng)的C3H10T1/2細胞分為對照組與成軟骨誘導組，分別加入含2%胎牛血清的DMEM和軟骨誘導液誘導培養(yǎng)。每3 d換液1 次，于第0、7、10、14日收集細胞微球進行基因表達檢測。

2.雙熒光素酶報告基因構建及檢測

使用在線靶基因預測軟件(PicTar、TargetScan、miRanda、miRDB)，預測NFATc1 mRNA的3’UTR上173～185 nt為miR-124的結合位點(GCACTTT)。人工合成NFATc1 mRNA 3’UTR 區(qū)的靶點野生型序列(Wt)以及定點突變的突變序列(Mut, GCACTTT→CGTGAAA)； XhoⅠ及NotⅠ雙酶切pmiR-RB-REPORTTM 質粒，再將Wt和Mut基因片段分別克隆到酶切后的pmiR-RBREPORTTM載體中，構建重組質粒pNFATc1-Wt或pNFATc1-Mut；基因測序確認重組質粒載體構建成功。按照試劑盒說明書突變NFATc1 3’UTR上miR-124結合位點，構建突變型pGL3-Mut-NFATc1真核表達載體。

取培養(yǎng)的C3H10T1/2細胞，根據轉染質粒的不同分為4組：①pNFATc1-Wt質粒對照組，為轉染pNFATc1-Wt質粒及miR-124 mimics對照；②pNFATc1-Wt質粒實驗組，為轉染pNFATc1-Wt質粒和miR-124 inhibitors；③pNFATc1-Mut質粒對照組，為轉染pNFATc1-Mut質粒與miR-124 mimics對照；④pNFATc1-Mut質粒實驗組，為轉染pNFATc1-Mut質粒與miR-124 inhibitors。各組轉染24 h后收集細胞，用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測各組細胞的熒光素酶活性。每組實驗重復3次，結果取平均值。另外，將NFATc1的3’UTR用XhoI/NotI點雙酶切，插入到psiCHECKTM-2質粒中復制，與此相關的NFATc1 3’UTR片段被融合到熒光素酶中，并被轉移到C3H10T1/2細胞，根據轉染質粒分為不轉染對照組(空白對照組)、miR-124 mimics組、miR-124 inhibitors組、pNFATc1-Wt質粒或pNFATc1-Mut組(正常對照組)、pNFATc1-Wt質粒或pNFATc1-Mut質粒加miR-124 inhibitors組(正常對照inhibitors組)，分析miR-124對NFATc1熒光素酶活性的影響。

3.實時定量PCR檢測

在成軟骨誘導分化第0、7、10、14日收集C3H10T1/2細胞微球，按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，并檢測總RNA的含量及純度，再按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，合成模板DNA第一鏈，實時定量PCR擴增目的基因，引物序列見表1。反應條件為95℃10 min，95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)，內參為18 s。一步加A法逆轉錄miR，反應條件為95℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，內參為U6。上下游引物序列分別為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，使用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。每組實驗重復3次，結果取平均值。記錄軟骨分化的相關標志基因Aggrecan、Ⅱ型膠原蛋白(Col2a1)和Ⅹ型膠原蛋白(Col10a1)及Sox9 mRNA表達水平。另外，取成軟骨誘導7 d的C3H10T1/2細胞轉染pNFATc1-Wt質粒(Control組)、pNFATc1-Wt質粒及miR-124 mimics(miR-124組)、經siRNA干預的pNFATc1-Wt質粒(si-NFATc1組)，按前述方法檢測NFATc1 mRNA表達水平。此外，取成軟骨誘導7 d的C3H10T1/2細胞，轉染miR-124 mimics和(或)pNFATc1-Wt質粒，轉染成功后分別加入miR-124 mimics 0、50、100 nmol/L miR-124 mimics或inhibitors培養(yǎng)24 h，用前述同樣方法分析各組NFATc1和miR-124 mRNA表達水平。

4.蛋白免疫印跡法檢測

提取各組細胞的總蛋白，測定蛋白濃度，加4倍SDS上樣緩沖液8 μl和二硫蘇糖醇2 μl混勻沸水浴5 min后作十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝膠電泳電泳，用電轉印儀(100 V電壓)電泳將凝膠上的蛋白轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將蛋白Marker剪下，避光保存，余下膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST緩沖液洗滌3次后，一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液再次洗滌3次，加入二抗室溫孵育2 h，同前洗滌。按體積比1∶1混合ECL試劑盒中A液和B液，混合液鋪在膜表面，凝膠成像系統(tǒng)曝光，Quantity one軟件分析結果。

表1 PCR引物序列

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、C3H10T1/2軟骨分化相關基因及蛋白表達的變化

成軟骨誘導組中，在成軟骨誘導分化第7、10、14日的軟骨分化相關基因Aggrecan mRNA表達水平均逐漸升高(與誘導前比較，t分別為30.274、

46.132、160.752，P均<0.001)；Col2a1 mRNA相對表達量在第7、10日升高(與誘導前比較，t分別為10.246、67.202、45.311，P均<0.001)，第14日稍下降(與誘導前比較，t=53.244、P<0.001；與第10日比較，t=2.376、P>0.05)；Col10a1第7、10日增加緩慢(與誘導前比較，P均>0.05)，但第14日大幅上調(與誘導前比較，t=330.784，P<0.001)。軟骨分化后, 軟骨化基因表達逐漸穩(wěn)步增加，但并未達到峰值；Sox 9和NFATc1 mRNA表達水平隨著軟骨分化進展而增加(與對照組0 d及10 d時比較，t分別為65.266、80.232，P均<0.001)，見圖1A～D。蛋白免疫印跡法顯示，成軟骨誘導組Col2a1、Sox 9和NFATc1蛋白呈逐漸增強表達，表明軟骨發(fā)生的進展，而肥厚性標記Col10a1蛋白顯示較穩(wěn)定表達(圖1E)。

二、miR-124對NFATc1的靶向性檢測

通過Targetscan和miRanda等在線軟件分析，發(fā)現NFATc1是miR-124的潛在靶基因之一， NFATc1 mRNA的3’UTR與miR-124的種子區(qū)存在理論上的互補堿基配對序列(圖2A)。轉染NFATc1 Wt質粒的對照組熒光素酶活性低于實驗組(t=3.837，P<0.05)；轉染NFATc1 Mut質粒的實驗組與對照組間熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；轉染NFATc1 Wt質粒的實驗組NFATc1蛋白表達水平高于對照組(圖2B)，表明miR-124直接作用于NFATc1。

圖1 C3H10T1/2誘導成軟骨分化的相關基因表達水平變化

miR-124組與si-NFATc1組的NFATc1 mRNA表達水平均低于Control組(LSD-t分別為5.642、4.338，P均<0.01)，miR-124組與si-NFATc1組的NFATc1 mRNA表達水平接近(P>0.05)；蛋白免疫印跡檢測結果與實時定量PCR結果基本一致(圖2C)，表明miR-124能在C3H10T1/2軟骨分化的過程中靶向調控NFATc1表達。

圖2 miR-124 通過靶向NFATc1促進C3H10T1/2細胞軟骨分化

A：互補堿基配對序列；B：NFATc1 熒光素酶活性檢測結果和NFATc1蛋白表達；C：miR-124抑制NFAc1 mRNA和蛋白表達；與共轉染NFATc1 Wt質粒的對照組熒光素酶活性比較，*P<0.01；與Control組比較，#P<0.01

三、抑制或過表達miR-124時C3H10T1/2的NFATc1表達水平變化

與未加入miR124 mimics相比，100 nmol/L的miR-124 mimics加入C3H10T1/2細胞后，miR-124 mRNA表達水平約增加60倍，而NFATc1 mRNA表達水平約降低60%(圖3A)。當100 nmol/L miR-124 inhibitors加入C3H10T1/2細胞時，與未加入時相比，miR-124 mRNA表達水平減少了大約60%，而NFATc1增加了大約1倍(圖3B)。轉染NFATc1-Wt質粒的miR-124 mimics組NFATc1熒光素酶活性低于其他4組(F=8.256，LSD-t分別為5.436、7.442、3.433、6.282，P均<0.05)，轉染NFATc1-Mut質粒的miR-124 mimics組NFATc1熒光素酶活性與其他4組相近(P均>0.05)，表明miR-124可作為NFATc1的抑制劑(圖3C)。

討 論

C3H10T1/2細胞系是一種小鼠胚胎源性間充質干細胞，具有多向分化潛能，轉染效率高且穩(wěn)定，易獲得大量轉染成功的活細胞，現已廣泛用于研究MSC分化潛能的實驗中[8]。miR作為一類重要的轉錄后調控因子，在MSC的分化過程中參與調控細胞的多種生物學過程[9-10]。已有研究發(fā)現，miR在調控MSC或前體細胞成軟骨、成骨及成脂的分化過程中發(fā)揮重要生物學功能[11]。miR-124能抑制MSC向軟骨分化[12]。上述研究證實，miR可通過抑制靶基因的表達參與MSC分化的調控。然而其中的分子機制和調控的靶基因尚不清楚。本課題組前期實驗首先誘導的C3H10T1/2細胞向軟骨的定向分化，在此過程中發(fā)現miR-124表達逐漸下調，提示其在MSC軟骨分化中可能具有重要的調控作用；然后通過生物信息學分析預測出miR-124潛在的其中一個靶基因NFATc1。本研究亦顯示，軟骨分化后NFATc1和軟骨化相關基因及蛋白表達逐漸穩(wěn)步增加。

圖3 干擾NFATc1或過表達miR-124時C3H10T1/2的NFATc1表達水平變化

與其他4組比較，*P<0.05

本研究將NFATc1 3’-UTR克隆入熒光素酶報告載體并且與miR-124共轉染C3H10T1/2細胞，結果顯示miR-124抑制NFATc1 mRNA的3’UTR熒光素酶活性，發(fā)現其特異性與NFATc1 mRNA的3’UTR相結合。然而在生理狀態(tài)下，靶基因3’UTR序列中的miR結合位點有可能由于mRNA的構象而被掩蓋，導致該miR無法發(fā)揮抑制靶基因表達的功能。因此進一步檢測該miR與NFATc1 3’UTR的結合能力及其對NFAc1表達的抑制作用，結果表明miR-124能抑制軟骨分化過程中的NFATc1 mRNA及蛋白表達，并且其強度與NFATc1 siRNA干擾NFATc1內源性表達一致，證明了miR-124直接靶向調控NFATc1表達。通過功能研究siRNA干擾NFATc1表達能抑制MSC的成軟骨化，它能部分模擬miR-124調控MSC軟骨分化的功能。另外，蛋白免疫印跡檢測結果也顯示轉染miR-124 mimics后，NFATc1的蛋白相對表達量比對照組明顯下調；相反，轉染miR-124 inhibitor后NFATc1的蛋白相對表達量與對照組比較則上調，表明在C3H10T1/2細胞成骨分化過程中miR-124通過調控靶基因NFATc1介導MSC向軟骨方向分化。

綜上所述，本研究運用生物信息學方法對miR-124和NFATc1基因的靶向配對關系進行預測，發(fā)現兩者靶向配對良好，采用熒光素酶報告系統(tǒng)、實時定量PCR及蛋白免疫印跡法發(fā)現miR-124可靶向抑制NFATc1的表達而負向調控C3H10T1/2細胞成軟骨分化。鑒于NFATc1是鈣形成信號通路中的重要轉導因子之一，因此miR-124調控成軟骨分化的作用機制可能是通過抑制NFATc1的表達，因此阻礙其下游信號通路的激活，進而抑制MSC的成軟骨分化。

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