新生獼猴UCMSC的制備、鑒定及對老年獼猴自發(fā)DM的治療作用

朱向情，王 強，蔡學敏，李自安，龐榮清，魏 玲，潘興華

糖尿?。―M）是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，可導致多種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙[1]。隨著人口結構的老化，DM的患病率也在增高。西方國家老年(＞65歲)DM的患病率約20%，我國老年(＞60歲)DM的患病率也在顯著增長[2]。DM是老年人的多發(fā)病、常見病，其并發(fā)癥已成為繼心血管、腦血管及痛癥等疾病之后的主要死亡原因，嚴重影響老年人的健康。本研究建立了獼猴臍帶間充質干細胞（UCMSC）體外制備方法，證實其具有分化為脂肪、骨、軟骨和胰島樣細胞的能力，并進一步探討了UCMSC對老年獼猴自發(fā)性DM的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設備 DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），新生牛血清（美國Gibco公司），雙抗（美國Hyclone公司），檸檬酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司），NaCl（上海凌峰化學試劑有限公司），超氧化物岐化酶測試盒（南京建成），淋巴細胞分離液（南京建成），百萬級層流超凈工作臺（SW-CL-2F型，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司），百級層流超凈工作臺（吳江市綠鳥凈化設備廠），倒置相差顯微鏡（BX60型，日本奧林巴斯），LEICA RM2135組織切片機（德國萊卡）。

1.2 實驗動物 自發(fā)性DM老年獼猴1只，24周歲，雌性，由中國醫(yī)學科學院昆明醫(yī)學生物學研究所實驗動物中心提供，于普通級環(huán)境下，按照常規(guī)條件飼養(yǎng)觀察。

1.3 獼猴UCMSC分離、擴增 取健康足月妊娠獼猴，3%戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥，常規(guī)消毒、鋪巾，剖腹取臍帶并立即浸泡于含有雙抗20%DMEM-12胎牛血清培養(yǎng)基中。在無菌條件下，剔除臍動脈、臍靜脈和被膜組織，0.9%的生理鹽水沖洗，剪成體積小于1×1×1 mm3的組織塊，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，使組織塊均勻分布于瓶底，加入20%DMEM-F12胎牛血清培養(yǎng)基1 ml浸潤組織塊，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6～12 d后第1次換液。待細胞融合達80%時，用0.25%胰酶消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4 UCMSC分化能力鑒定

1.4.1 成骨誘導分化 將細胞以3×104/cm2的密度接種在6孔板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h至達到80%融合，更換成骨分化培養(yǎng)基進行誘導。此后，每2 d換成骨分化培養(yǎng)基1次。分化誘導21 d后，固定細胞，并用茜素紅進行鈣結節(jié)染色（MSC go Osteogenic XFTM，BI，Israel）。

1.4.2 成脂分化誘導 將細胞以3×104/cm2的密度接種在6孔板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h至達到80%融合，更換成脂分化培養(yǎng)基進行誘導。此后，每2 d換成脂分化培養(yǎng)基1次。分化誘導14 d后，固定細胞，并用油紅O染色（MSC go Adipogenic XFTM，BI，Israel）。

1.4.3 成軟骨分化誘導 將細胞以3×105/cm2的密度接種在6孔板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h至形成球體，更換成軟骨分化培養(yǎng)基進行誘導。此后，每4 d換成軟骨分化培養(yǎng)基1次。分化誘導21 d后，固定細胞，并用阿爾辛藍染色（MSC go Chondrogenic XFTM，BI，Israel）。

1.4.4 成胰島細胞分化誘導采用四步法：第一步，將細胞以3×105/cm2的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，用含2%B27、11.1 mM葡萄糖、4 nM activin A的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，用含有0.1 mM丁酸鈉的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，用膠原酶Ⅳ，將細胞制備成細胞懸液，轉移至超低粘附6孔板。第二步，用含2%B27、20 ng/ml EGF、2 ng/ml bFGF、100 ng/ml Noggin 的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 w。第三步，用含2%B27、EGF(20 ng/ml)、Noggin(100 ng/ml)的 RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)1 w。第四步，用含BSA(0.5%)、nicotinamide(10 mM)、胰島素樣生長因子Ⅱ(50 ng/ml)的 RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d。每個步驟用都是3～4 d換1次液。最后用insulin免疫熒光染色

1.5 UCMSC細胞治療 將上述分離、純化并鑒定后的UCMSC調整濃度為5×106個/ml，并按照5×106個/kg經(jīng)靜脈輸入自發(fā)性DM老年獼猴，1次/2 w，連續(xù)3次。

1.6 療效評價 收集UCMSC治療前及治療后2 w的自發(fā)性DM老年獼猴血清，采用自動生化分析儀檢測葡萄糖（Glu）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、血清胰島素（INS）、血清 C-肽（C-P）含量。

2 結果

2.1 獼猴UCMSC表型 收集傳代至第3代的UCMSC，通過流式細胞分析，CD34和CD45表達率分別為0.098%和0.75%；CD44和CD29表達率分別為96.2%和99.4%。見圖1。

2.2 獼猴UCMSC體外分化能力 收集傳代至第3代 UCMSC（圖2A），分別向軟骨樣細胞、骨樣細胞、脂肪樣細胞、胰島樣細胞誘導分化，在分化誘導完成后，去除培養(yǎng)基成分，4%甲醛固定細胞后，茜素紅染色。從圖2可見，UC-MSC可以誘導分化為軟骨樣細胞，阿爾辛藍染色為陽性（圖2B）；UC-MSC可以誘導分化為骨樣細胞，茜素紅染色為陽性（圖2C）；UC-MSC可以誘導分化為脂肪樣細胞，油紅O染色為陽性（圖2D）；UC-MSC可以誘導分化為胰島樣細胞，insulin免疫熒光染色為陽性（圖2E）。表明獼候UCMSC具有向軟骨、骨、脂肪、胰島細胞分化的潛能。

2.3 UCMSC對DM的治療作用 UCMSC治療3次后，自發(fā)性DM老年獼猴血清Glu、TG、TC含量均顯著降低，而INS、C-P均顯著升高（表1）。

3 討論

UCMSC是一種具有自我更新和多向分化潛能的細胞，能分化成多種不同的細胞譜系，如骨、脂肪、軟骨等間質細胞譜系，以及神經(jīng)元、肝細胞和內皮細胞等內胚層和神經(jīng)外胚層細胞[3-4]。體內外實驗證實，UCMSC可分化為能夠分泌胰島素的功能細胞[5-6]。UCMSC具有參與損傷修復、分泌生長因子、調節(jié)免疫、抑制炎癥、促進代謝、抗氧化應激等多方面的生物效應，利用這些生物效應對DM進行治療，對促進胰腺損傷修復、改善代謝功能、改善糖代謝、治療和預防DM等均會產(chǎn)生積極作用。研究發(fā)現(xiàn)，同基因或異基因MSC移植給DM鼠后，可快速降低血糖水平，有效逆轉其高血糖癥狀[7]。

圖1 新生獼猴UCMSC的免疫表型流式分析

圖2 UCMSC成軟骨、成骨、成脂、成胰分化

表1 UCMSC治療前后DM相關指標的變化

本實驗成功分離、培養(yǎng)并獲得了獼猴UCMSC，流式分析結果顯示，免疫表型為CD44（96.2%）和CD29（99.4%）表達陽性，CD45（0.75%）和 CD34（0.098%）表達陰性。同時檢發(fā)現(xiàn)其可以分化為脂肪樣細胞、骨樣細胞、軟骨樣細胞和胰島樣細胞，表明所獲得的UCMSC符合間充質類干細胞的標準。利用其治療自發(fā)性DM老年獼猴后，血清Glu、TG、TC含量均顯著降低，而INS、C-P均顯著升高，表明UCMSC對老年自發(fā)性DM有一定治療效果。分析其機制，可能是：（1）分泌多種細胞因子，抑制胰島細胞凋亡，支持胰腺功能，促進其功能的恢復[8]。（2）分化為胰島β細胞，替代受損的β細胞，增加胰腺細胞的數(shù)量，修復受損胰腺[9]。（3）減少機體由于異常代謝產(chǎn)生的免疫和慢性炎癥反應，阻止胰島β細胞的進一步受損，同時減輕胰腺以及其他組織的炎癥反應，緩解胰島素抵抗，提高組織對胰島素的敏感性[10]。

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