氨茶堿藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

李 霽陽 劍*張 源

（1 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650021；2 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，云南 昆明 650032）

藥代動(dòng)力學(xué)是藥學(xué)、藥物制劑、臨床藥學(xué)等專業(yè)的主干專業(yè)課程之一，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、制劑研究和藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)、臨床合理用藥等方面，是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的課程[1-2]。藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)是教學(xué)的重要組成部分，是理論與實(shí)踐結(jié)合的主要方式之一，我校主要是臨床藥學(xué)專業(yè)開設(shè)了藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)課。其中“氨茶堿在兔子體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究”中藥動(dòng)參數(shù)的測(cè)定是主要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一，對(duì)于學(xué)生理解并掌握通過血藥濃度的測(cè)定來獲取藥物的藥動(dòng)參數(shù)具有重要的指導(dǎo)意義，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括血樣的采集、樣品前處理、血藥濃度的測(cè)定及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。在實(shí)驗(yàn)帶教過程中，筆者認(rèn)為在檢測(cè)過程中，當(dāng)選擇274 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，血中的內(nèi)源性成分在該波長(zhǎng)處有吸收，對(duì)測(cè)定有干擾，有必要選擇更為合理的測(cè)定方法，使測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確合理；此外實(shí)驗(yàn)中使用5%異丙醇-氯仿作為提取溶劑，對(duì)人體毒性大且污染環(huán)境，需要尋找一種能夠滿足氨茶堿藥代動(dòng)力學(xué)研究要求，替代氯仿，安全的提取溶劑。因此經(jīng)過分析、查閱資料、預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了改革，改革后的實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，提取回收率較高，能夠滿足氨茶堿藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，且無毒無害，適合學(xué)生教學(xué)實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 氨茶堿藥代動(dòng)力學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)況

我校采用的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)講義中，氨茶堿在兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究是通過給家兔耳靜脈給藥注射用氨茶堿后耳靜脈取血，使用5%異丙醇-氯仿對(duì)血樣進(jìn)行液液萃取前處理后采用紫外分光光度法在274 nm處測(cè)定血藥濃度，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理：繪制藥時(shí)曲線、將測(cè)得的血藥濃度代入藥動(dòng)公式求算消除速率常數(shù)K、半衰期t等藥動(dòng)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括血樣的采集、血樣的前處理、血藥濃度的測(cè)定及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。其中生物樣品前處理和血藥濃度測(cè)定是本實(shí)驗(yàn)的重要內(nèi)容，涉及到后續(xù)測(cè)定是否準(zhǔn)確合理。

目前氨茶堿的含量測(cè)定方法主要有紫外分光光度法[3-4]HPLC法[5-6]，因紫外分光光度法操作簡(jiǎn)捷、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、儀器價(jià)格便宜而被廣泛用于學(xué)生實(shí)驗(yàn)中。在以前設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)中，選擇紫外光274 nm下測(cè)定氨茶堿血藥濃度，使用5%異丙醇-氯仿進(jìn)行液液萃取，實(shí)驗(yàn)得率高，現(xiàn)性好，但最主要的問題血中內(nèi)源性成分在274 nm下有吸收，容易產(chǎn)生干擾，使結(jié)果不夠準(zhǔn)確；此外提取溶劑氯仿毒性大，對(duì)心、肝、腎有損害，吸入后容易中毒，在學(xué)生實(shí)驗(yàn)中使用不合適，為此需要改進(jìn)檢測(cè)方法，提高方法的準(zhǔn)確性，并且尋找到提取率能夠滿足氨茶堿藥代動(dòng)力學(xué)研究的、合適的提取溶劑，從而替代氯仿。

2 改革后的實(shí)驗(yàn)方法

2.1 家兔空白血的采集 取體重3 kg左右家兔1只，耳緣動(dòng)脈取血或心臟取血20～80 mL，置于加有肝素的10 mL具塞離心管中，離心 (3000 rpm/min)10 min，取血清供標(biāo)準(zhǔn)曲線制備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取氨茶堿標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱量以0.1 mol/L NaOH溶液配成500 mg/L的貯備液。另取試管5支，各加入0.5 ml空白血清，然后依次加入上述貯備液4.0 μL、8.0 μL、12.0 μL、16.0 μL、20.0 μL，各加入0.1 mol/L NaOH溶液至4.0 mL，其濃度分別為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL、2.0 μg/mL、2.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。按生物樣品前處理，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)274 nm及波長(zhǎng)298nm處測(cè)定吸收度A274、A298（以空白血清按生物樣品前處理后作空白對(duì)照）以吸收度差△A（A274-A298）對(duì)含藥量C進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見圖1。

圖1 氨茶堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 生物樣品前處理 取血清樣品0.5 mL置試管中，加0.1 mol/L鹽酸溶液0.2 mL，乙酸乙酯液5 mL，振搖混合，離心（3000 r/min） 10 min。吸取乙酸乙酯4.0 mL置于另一試管中，加入0.1 mol/L NaOH溶液4.0 mL，混勻，離心10 min，吸取堿液（上層）3～3.5 mL，用紫外分光光度計(jì)，測(cè)定堿液在波長(zhǎng)274 nm和波長(zhǎng)298 nm處的吸收度A274、A298。

2.4 稀釋效應(yīng) 考慮到氨茶堿靜注給藥血清樣品濃度高，需用兔空白血清稀釋，以滿足氨茶堿的血清標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍。由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可知，部分兔血清樣品需要稀釋，稀釋倍數(shù)為5、25倍。因此，需要考察氨茶堿血清樣品的稀釋效應(yīng)。由于將血清樣品直接稀釋25倍會(huì)引入較大的操作誤差，因此本實(shí)驗(yàn)操作將高濃度血清樣品先稀釋5倍，再將稀釋5倍后的血清樣品稀釋5倍，由此得到稀釋25倍的血清樣品。

為此，血清樣品的稀釋效應(yīng)考察方法如下：配制成濃度為10.0 μg/mL的氨茶堿標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，分析前樣品保存于20℃，分析時(shí)將其稀釋5倍，得到濃度為2.0 μg/mL樣品，按上述氨茶堿血清樣品預(yù)處理步驟操作并進(jìn)樣分析，所得氨茶堿吸光度差值△A代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)濃度，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即獲得高濃度血清樣品的實(shí)際測(cè)定濃度，通過與標(biāo)準(zhǔn)添加濃度相比較，計(jì)算其百分回收率與RE值，結(jié)果見表1。

表1 氨茶堿稀釋效應(yīng)考察 （n=5）

2.5 家兔體內(nèi)血藥濃度的測(cè)定

2.5.1 血樣的采集 選用雄性家兔稱重，按10 mg/kg劑量給藥，以5%葡萄糖溶液稀釋氨茶堿注射劑10倍，由耳靜脈給藥（2 min內(nèi)注完）。然后分別于0.167 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h取血約2 mL（另一耳靜脈取血）。分離血清（試管不涂肝素，靜置，離心2000 rpm），備用。按生物樣品前處理，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)274 nm及波長(zhǎng)298 nm處測(cè)定吸收度A274、A298，計(jì)算吸收度差△A后，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到氨茶堿血藥濃度。

2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 繪制藥時(shí)曲線，將測(cè)得的血藥濃度代人藥動(dòng)公式求算消除速率常數(shù)K、半衰期t等藥動(dòng)參數(shù)。

3 結(jié)果

用改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得血藥濃度數(shù)據(jù)見表2，繪制的藥時(shí)曲線見圖2。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，測(cè)得的血藥濃度數(shù)據(jù)符合對(duì)氨茶堿在家兔體內(nèi)的代謝情況，與靜脈給藥藥-時(shí)曲線的規(guī)律一致，且在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后的方法對(duì)血樣進(jìn)行處理后所得的樣品澄明，血藥濃度測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

表2 血藥濃度測(cè)定結(jié)果

圖2 血藥濃度-時(shí)間曲線

4 討論

4.1 實(shí)驗(yàn)特點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)在生物樣品前處理過程中使用乙酸乙酯作為萃取溶劑來替代原先使用的萃取溶劑5%異丙醇-氯仿，提取回收率較高，滿足藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)需要。此外使用兩點(diǎn)校正法測(cè)定并計(jì)算血藥濃度，較之前在274 nm測(cè)定血藥濃度，該方法更加準(zhǔn)確，能夠扣除血樣中其他內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，血藥濃度測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。實(shí)驗(yàn)無毒無害，適合學(xué)生操作。

表2 改革前后實(shí)驗(yàn)比較

4.2 實(shí)驗(yàn)收獲 本次實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)工作包括文獻(xiàn)查閱、實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)到實(shí)際操作、儀器使用、數(shù)據(jù)處理等多項(xiàng)工作都是筆者帶領(lǐng)學(xué)生完成，學(xué)生在參與本次實(shí)驗(yàn)改革中，熟練掌握了查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)的方法，了解了科學(xué)研究的基本思路與流程，加深了對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)基本理論知識(shí)的理解，掌握了相關(guān)儀器的使用以及獲得較強(qiáng)的數(shù)據(jù)處理能力。實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生充分利用數(shù)據(jù)庫資源，在實(shí)驗(yàn)中遇到的相關(guān)問題能夠通過查閱文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，有效激發(fā)了獨(dú)立思考，對(duì)于培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立分析、解決實(shí)際工作中出現(xiàn)的問題及動(dòng)手能力有很大的幫助。實(shí)踐證明，本次實(shí)驗(yàn)改革，相對(duì)于以前的實(shí)驗(yàn)課程，增加實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和合理性，讓學(xué)生更深層地理解了藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的過程、意義，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確合理，試劑對(duì)環(huán)境和人體無害，適合學(xué)生教學(xué)實(shí)驗(yàn)。

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