氫譜磁共振代謝組學(xué)在2型糖尿病特征代謝物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

張志軍 馬 紅 董繼揚(yáng)

(廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院干部保健科，福建 廈門 361004)

2型糖尿病(T2DM)起病隱匿、進(jìn)展緩慢，往往出現(xiàn)相關(guān)癥狀的時(shí)候，已經(jīng)發(fā)展到中期甚至晚期，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。T2DM是多因素參與的整體代謝性紊亂，其調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜。以前的研究主要是利用分子生物學(xué)和生物化學(xué)等方法，通過檢測(cè)單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)成分的變化來獲得疾病的相關(guān)信息，忽略了整體器官中動(dòng)態(tài)的代謝變化，很難了解體內(nèi)的整體紊亂，也無法做到對(duì)疾病的早期預(yù)警。代謝組學(xué)技術(shù)主要提取生物體液(如尿液、血液)或組織中分子量小于1 000 kD的小分子代謝物信息，揭示系統(tǒng)關(guān)聯(lián)生物標(biāo)記物的綜合差異，可以從整體上全面分析疾病對(duì)生物系統(tǒng)的影響，能夠?yàn)樘悄虿?DM)的代謝研究提供良好的技術(shù)平臺(tái)。磁共振(NMR)技術(shù)作為一種非侵入和高效的檢測(cè)手段，是代謝組學(xué)普遍采用的方法，廣泛應(yīng)用于生物體液的研究。本文將基于1H-NMR的代謝組學(xué)方法應(yīng)用于T2DM尿液特征代謝物的尋找。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 T2DM組：廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)分泌科2012～2013年住院患者98例，平均年齡(58.58±8.69)歲，符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，血清谷氨酸脫羧酶(GAD)抗體檢測(cè)均為陰性；排除急性感染、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、腫瘤、家族性遺傳性疾病等。健康對(duì)照組：廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院體檢中心2012～2013年健康志愿者82例，平均年齡(55.34±9.54)歲，血、尿常規(guī)、生化檢查均無明顯異常。所有參與本試驗(yàn)的志愿者同意參與本研究，被告知本試驗(yàn)的目的及意義，并簽署知情同意書。

1.2樣品采集 收集研究對(duì)象清晨中段尿液3 ml，收集后1 h內(nèi)經(jīng)臺(tái)式超速離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，取上清液0.6 ml，放入-80℃冰箱儲(chǔ)存，1個(gè)月內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。

1.3NMR制譜 進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)時(shí)，解凍尿液樣品至常溫，取樣品500 μl與250 μl磷酸鹽緩沖液混合，以消除pH變化對(duì)化學(xué)位移的影響，加入適量的2，2-二甲基-2-硅烷-5-磺酸鈉(DSS)作為化學(xué)位移零點(diǎn)的定標(biāo)，用5 mm樣品管，在Varian NMR System 5 000 MHz譜儀上采集樣品1H NMR譜。實(shí)驗(yàn)采用5 mm HCN三共振探頭，溫度300 K，譜寬5 kHz，信號(hào)累加128次，用NOEPR采樣并抑制水峰信號(hào)。

1.4數(shù)據(jù)預(yù)處理 采用MestRe-C 2.3軟件及自編程軟件對(duì)譜圖的手工相位調(diào)節(jié)、基線校正和譜峰對(duì)齊。并將δ 4.5～δ 6的譜峰強(qiáng)度置為零，截取化學(xué)位移δ 0.7～δ 9區(qū)間，以消除殘留水信號(hào)對(duì)分析結(jié)果的影響。為了減少噪聲和化學(xué)位移漂移的影響，采用自適應(yīng)分段積分的方法，通過分段積分，得到1個(gè)觀測(cè)數(shù)據(jù)矩陣。最后將數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化，采用sup-PQN面歸一化，歸一后再用Pareto進(jìn)行列歸一，應(yīng)用主成分分析(PCA)方法刪除得分圖上明顯不符合的離群點(diǎn)，進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將預(yù)處理結(jié)果導(dǎo)入MATLAB平臺(tái)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用PLS-DA進(jìn)行判別分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NMR譜圖分析 根據(jù)相應(yīng)的化學(xué)位移和波譜形態(tài)，可以得到尿液中主要代謝物成分信息如下：異亮氨酸(δ 0.85)、甲基丙二酸(MMA，δ 1.18)、乳酸(δ 1.33)、丙氨酸(δ 1.48)、亮氨酸(δ 1.75)、檸檬酸(δ 2.56，2.72)、二甲胺(DMA，δ 2.73)、三甲胺(TMA，δ 2.92)、肌酐(δ 3.05，4.05)、甜菜堿(δ 3.27)、氮氧三甲胺(TMAO，δ 3.27)、葡萄糖(δ 3.2～δ 4.0)等。T2DM組和健康對(duì)照組尿液中葡萄糖、氮氧三甲胺、檸檬酸水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他代謝物的濃度變化很難識(shí)別，并且由于存在個(gè)體差異，單個(gè)樣本的代謝物差異不足以代表全部樣本。

2.2T2DM和健康對(duì)照組尿液代謝產(chǎn)物的PLS-DA分析 通過PLS-DA的模式識(shí)別分析方法，可以明顯地將T2DM及健康對(duì)照組區(qū)分開。相對(duì)于健康對(duì)照組，T2DM組的樣本分布比較分散，這是由于T2DM組的代謝產(chǎn)物個(gè)體差異較大造成的。在負(fù)載圖中，葡萄糖、乳酸、乙酸的特征變量偏離負(fù)載圖中心點(diǎn)最遠(yuǎn)，說明這三種成分是引起T2DM組和健康對(duì)照組類別差異的重要參數(shù)。除了以上3種成分，其他遠(yuǎn)離中心點(diǎn)的化學(xué)位移對(duì)負(fù)載圖也有突出貢獻(xiàn)，這說明導(dǎo)致兩組樣本類別差異的代謝物還包含了其他特征代謝物。根據(jù)負(fù)載圖中的特征變量，我們得到了T2DM尿液中的特征代謝物，經(jīng)過t檢驗(yàn)后，T2DM與健康對(duì)照組尿液代謝產(chǎn)物比較，乙酸、乳酸、牛磺酸、乙酰乙酸、葡萄糖、丙氨酸、甲基丙二酸含量升高，肌酐、檸檬酸、三甲胺含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)。

3 討 論

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，也是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)代謝物全面、實(shí)時(shí)、系統(tǒng)的輪廓分析，并且可對(duì)代謝物因飲食、生活方式、服藥等影響而發(fā)生的變化進(jìn)行描述和評(píng)估。實(shí)驗(yàn)中，由于T2DM患者存在糖代謝障礙，使丙酮酸氧化障礙，無法完全進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在細(xì)胞液中堆積，導(dǎo)致乳酸升高。T2DM患者普遍存在微循環(huán)障礙，細(xì)胞供氧不良，乳酸脫氫氧化成丙酮酸的過程被抑制，也是造成T2DM患者體內(nèi)乳酸升高的原因。乳酸性酸中毒死亡率高，預(yù)后較差，所以對(duì)T2DM患者血液乳酸水平的檢測(cè)顯得尤為重要。國(guó)外研究報(bào)道，乳酸在人體內(nèi)存在兩種立體異構(gòu)體，L-乳酸和D-乳酸，D-乳酸含量較少，但其神經(jīng)毒性遠(yuǎn)大于L-乳酸，應(yīng)當(dāng)將D-乳酸作為單獨(dú)的檢測(cè)項(xiàng)目〔1〕。T2DM患者體內(nèi)D-乳酸含量幾乎為正常人的2倍，其原因目前認(rèn)為是機(jī)體在高血糖狀態(tài)下，由升高的丙酮醛轉(zhuǎn)化而來。文獻(xiàn)指出丙酮醛加劇了機(jī)體組織的氧化應(yīng)激和糖基化過程，促進(jìn)了糖基化終末產(chǎn)物的形成，從而加速T2DM微血管并發(fā)癥和周圍神經(jīng)病變的進(jìn)程〔2〕。作為丙酮醛的終末產(chǎn)物，D-乳酸可以作為其體內(nèi)水平的參考。在臨床上開展針對(duì)D-乳酸的檢測(cè)，并深入探尋它在T2DM微血管及神經(jīng)病變中的貢獻(xiàn)，可以作為今后研究的一個(gè)方向。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)?；撬峋哂杏绊懱谴x，降低血糖的作用〔3〕。國(guó)外學(xué)者對(duì)其降糖作用進(jìn)行深入研究，機(jī)制主要涉及增加胰島素的敏感性〔4〕，減少胃腸道葡萄糖的吸收〔5〕，促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖的利用〔6〕。此外Winiarska等〔7〕研究指出，?；撬峥赡芡ㄟ^抑制糖異生來達(dá)到降血糖的作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，牛磺酸同時(shí)具有抗氧化和保護(hù)神經(jīng)的作用，對(duì)T2DM并發(fā)癥的預(yù)防和控制有一定作用。在本研究中，T2DM患者尿液中牛磺酸的水平升高，綜合相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果，我們考慮?；撬岬呐判乖黾?、體內(nèi)?；撬崴降南鄬?duì)不足，可能在一定程度上參與了T2DM的發(fā)生發(fā)展。

本研究中T2DM患者尿液中的甲基丙二酸的水平升高，原因可能為：①T2DM患者體內(nèi)氨基酸及脂肪的代謝異常。②T2DM患者體內(nèi)維生素B12不足。有文獻(xiàn)報(bào)道T2DM患者常用的二甲雙胍、羅格列酮等藥物會(huì)導(dǎo)致維生素B12缺乏〔8〕，本研究中T2DM患者服用二甲雙胍的比例較高，我們認(rèn)為這是尿液中甲基丙二酸水平增加的主要原因。美國(guó)的一項(xiàng)META研究指出，維生素B12、MMA的異常會(huì)增加多發(fā)性神經(jīng)病變的危險(xiǎn)性〔9〕，國(guó)內(nèi)研究也表明，在T2DM患者中，維生素B12水平降低會(huì)增加T2DM患者周圍神經(jīng)病變的發(fā)生率〔10〕。臨床上二甲雙胍相關(guān)性的VitB12缺乏一直被忽略，早期的VitB12缺乏無典型的臨床表現(xiàn)，但已經(jīng)存在潛在神經(jīng)系統(tǒng)損害〔11〕。MMA對(duì)維生素B12的早期缺乏較敏感，且MMA由腎臟排泄，尿液中含量較高，所以尿液中的MMA水平敏感地反映維生素B12的缺乏。對(duì)于長(zhǎng)期應(yīng)用二甲雙胍的患者，定期監(jiān)測(cè)尿液MMA的水平，預(yù)防T2DM周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展，具有一定指導(dǎo)意義。研究表明，多進(jìn)食富含檸檬酸的食物，能夠限制體內(nèi)糖基化終末產(chǎn)物的形成，從而延緩T2DM血管病變的進(jìn)程〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者尿液中檸檬酸的水平下降，這可能也是引起微血管病變的因素。

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