李春梅 王 馨 吳麗春 康立勛 李海清 馬晟利
(黑龍江省醫(yī)院口腔科,黑龍江 哈爾濱 150001)
2型糖尿病(T2DM)占糖尿病患病人群的93.7%〔1〕。糖尿病是代謝性疾病,由于長期胰島素分泌缺陷或者胰島素功能缺陷導(dǎo)致以高血糖為特征的一種系統(tǒng)性疾病〔2〕。淫羊藿苷是一種傳統(tǒng)的補益中藥,其性味辛、甘、溫,體現(xiàn)出強筋骨、補腎陽、祛風濕等各方面的作用。在臨床上被廣泛用于骨折、骨代謝相關(guān)的多種疾病的治療中,已取得了顯著療效〔3〕。Shh信號通路可以調(diào)控一些成骨相關(guān)因子的表達,如骨形成蛋白(BMP)22、BMP27、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)等〔4〕,因此在調(diào)控軟骨形成、骨形成、骨骼發(fā)育、異位成骨發(fā)揮重要作用。有學者〔5〕將外源性Shh基因轉(zhuǎn)入實驗性糖尿病大鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)Shh基因?qū)Υ笫蟮奈⒀苤厮堋?chuàng)口愈合等方面都有一個明顯的促進,說明Shh信號通路激活可以改善糖尿病大鼠的軟組織愈合。 Shh是一種典型的分泌蛋白,在體內(nèi)有較高的表達。合成后將會自我水解并形成C-片段和N-片段。其中N-片段的C-末端受到外部環(huán)境刺激而和膽固醇相結(jié)合,共同構(gòu)成活性空間結(jié)構(gòu)。一般情況下,只有在Shh存在的狀態(tài)下,補丁基因(PTCH)才能夠順利的和光滑基因(SMO)結(jié)合,從而產(chǎn)生對傳導(dǎo)通路的抑制作用。Shh影響之下,兩者相結(jié)合,從而客觀上消除了PTCH對SMO的抑制作用。Shh信號通路是一個多功能的信號通路,不但可以調(diào)控軟骨形成、骨形成、骨骼發(fā)育、異位成骨等,還可以促進糖尿病大鼠的軟組織愈合,使得血管重塑,創(chuàng)口愈合時間降低。本探討淫羊藿苷在高糖培養(yǎng)環(huán)境下,對大鼠骨髓基質(zhì)細胞Shh信號通路的影響。
1.1動物、試劑及儀器 取100 g左右雄性SD大鼠3只,頸椎脫臼處死。傳三代培養(yǎng),獲得骨髓基質(zhì)細胞〔4〕。Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、高純總RNA快速提取試劑盒RNase固相清除劑、Powder瓊脂糖、50×TAE2×Power Taq PCR MasterMix(武漢博士德生物工程有限公司)。超速冷凍離心機(湖南湘儀),微量移液器(BIOHIT),真空干燥箱(SYSBERY),紫外分光光度計(Thermo),熒光定量PCR儀(BIONEER)。
1.2實驗方法 實驗分為:正常組(2%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)的細胞),高糖組(2%胎牛血清+高糖-DMEM培養(yǎng)的細胞),淫羊藿苷組1(2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培養(yǎng)的細胞),淫羊藿苷組2(2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培養(yǎng)的細胞)。取各組細胞提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用韓國BIONEER公司生產(chǎn)的ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量分析。按照實驗方法中的步驟進行RNA提取,并利用紫外分光光度計對提取的RNA濃度進行測定。本實驗每種樣本每個基因進行4個復(fù)孔平行實驗,實驗數(shù)據(jù)的選取,是舍去誤差較大的數(shù)值,取剩余數(shù)值的平均值作為最終實驗保留數(shù)據(jù)。利用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù),以正常組為1。
1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。
淫羊藿苷組1 PTCH1(1.82±0.03)和SMO(1.50±0.07)基因表達明顯高于其他組,淫羊藿苷組2 PTCH1(1.44±0.02)和SMO(1.20±0.05)基因表達分別明顯高于高糖組(0.74±0.04,0.71±0.05)和正常組(1.00±0.03,1.00±0.02),說明淫羊藿苷增強高糖環(huán)境下骨髓基質(zhì)細胞的Shh信號通路表達能力。
糖尿病可引發(fā)骨代謝異常,進而導(dǎo)致多種糖尿病骨病(比如,骨量下降、骨折率上升等)??谇还莵G失會對患者產(chǎn)生兩種重要影響,其一為牙齒存留,其二為義齒修復(fù)〔6〕。此外,糖尿病可引發(fā)牙槽骨喪失,還會導(dǎo)致黏膜損傷,所以患者往往都對修復(fù)治療無法忍受。當糖尿病患者人數(shù)逐漸上升,而相關(guān)醫(yī)療水平也日益提升時,糖尿病治療亦日趨復(fù)雜化。糖尿病與牙周病之間存在一種雙向調(diào)節(jié)關(guān)系。當人發(fā)生急性感染后,其內(nèi)分泌狀態(tài)及其代謝狀態(tài)都會發(fā)生變化,因此血糖控制很差,所以牙周感染會對糖尿病患者造成影響,使其無法很好地控制血糖。有鑒于此,糖尿病治療應(yīng)注重牙周病的防治,否則可增加治療難度。但在現(xiàn)實生活中,口腔醫(yī)生對于糖尿病所引發(fā)的口腔并發(fā)癥往往是較為忽視的。此外,對于糖尿病患者而言,維護口腔健康是一件十分重要的事情,假如牙科醫(yī)生不能充分重視這一點,那么口腔健康也無法得到保障〔7〕。不過,對糖尿病患者口腔疾病的診療維護需要有足夠的糖尿病知識作后盾,而口腔科醫(yī)生在這方面最為欠缺,這些都是亟待解決的。淫羊藿苷是中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松最常用的藥物之一。作為淫羊藿的精華部分,淫羊藿苷在近年來被廣泛應(yīng)用于成骨、破骨細胞的干預(yù)研究中〔8〕。本研究結(jié)果說明高糖可以抑制Shh信號通路的激活,而高糖同時可以抑制骨髓基質(zhì)細胞的成骨,淫羊藿苷則能增強高糖環(huán)境下Shh信號通路的激活。
1靳思思,胡潔芬,吳 文.Shh在雷奈酸鍶促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中的作用〔J〕.中國病理生理雜志,2014;12(1):159-64.
2李 麗,蒙秋蓉,郭 琦,等.Shh信號參與調(diào)控BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細胞成骨分化〔J〕.中國生物工程雜志,2014;9(1):9-15.
3李 麗,董 謙,馮巧靈,等.Shh促進BMP9誘導(dǎo)的小鼠間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2的成骨分化〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床,2014;12(21):1629-34.
4李 麗,歐欣穎,吉彩霞,等.激活Shh信號通路促進BMP9誘導(dǎo)小鼠成肌細胞C2C12向成骨分化〔J〕.中國生物化學與分子生物學報,2015;5(6):481-8.
5陳美玲,宋 珂,黃夢琪,等.Shh修飾骨髓間充質(zhì)干細胞與不同骨移植材料復(fù)合的體外觀察〔J〕.臨床口腔醫(yī)學雜志,2011;3(10):138-40.
6宋 珂,饒念靜,陳美玲,等.bFGF及Shh時序傳遞促進骨再生的實驗研究〔J〕.中國口腔種植學雜志,2011;16(1):11-2.
7陳群力,周淑琴,須 冰,等.高效液相色譜法同時測定大黃靈脾顆粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量〔J〕.安徽醫(yī)藥,2016;21(1):46-9.
8張 攀,史 娟,劉 力,等.淫羊藿苷及其衍生物的抗氧化活性研究〔J〕.中國食品添加劑,2016;14402(5):85-8.