姜黃素通過上調PPARγ抑制糖基化終末產物誘導的軟骨細胞凋亡及線粒體功能損傷

楊青山，吳樹金，施松波，毛新展, 郭士方，陳志信，臺會平

(甘肅省人民醫(yī)院1. 骨科、2. 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；3. 中南大學湘雅二醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410011)

骨性關節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種隨年齡增長而發(fā)病率明顯增加的慢性關節(jié)疾病, 病因及機制復雜，迄今仍未闡明。糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)是體內蛋白質及脂類與葡萄糖或其他還原單糖發(fā)生非酶糖化反應生成的穩(wěn)定共價化合物，它在關節(jié)軟骨內大量產生與積聚是導致OA病變的重要原因之一[1]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，AGEs 能誘導軟骨細胞過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPARγ)的表達下調，并在OA 病變中起重要作用[2]。PPARγ的重要作用之一為可以通過其輔助活化因子-1α(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1 alpha，PGC-1α)，調控線粒體功能[3]，進而抑制細胞凋亡。

姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃中提取的一種黃色酸性酚類物質，是姜黃發(fā)揮藥理作用的活性成分。姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用[4-6]，同時近年研究發(fā)現(xiàn)其可以有效上調PPARγ，被認為是PPARγ的天然配體[7]。姜黃素基于PPARγ的作用靶點是否對AGEs誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用尚不清楚。因此，本研究將直接使用外源性AGEs以排除其他因素的影響，在體外培養(yǎng)的家兔軟骨細胞上，探討AGEs誘導軟骨細胞凋亡是否與PPARγ下調/線粒體功能損傷有關，同時觀察姜黃素是否基于上調PPARγ而發(fā)揮保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 普通級健康家兔(5周齡)由蘭州大學動物實驗中心提供。本研究中動物實驗遵循的所有程序均符合國家及甘肅省人民醫(yī)院制訂的有關實驗動物的規(guī)則和制度。

1.1.2試劑 環(huán)孢霉素A (cyclosporine A，CsA)、PPARγ抗體購自Calbiochem (La Jolla, CA, USA)；姜黃素(批號C1386)、PPARγ特異性抑制劑GW9662(批號70785)、吡格列酮 (批號P4120)，均購自Sigma公司；PPARγ活性檢測試劑盒購自Santa Cruz Biotechnology公司；ATP檢測試劑盒、TUNEL、Rhodamine-123、caspase-3活性檢測試劑盒，均購自碧云天生物技術公司；其余試劑均為化學分析純。

1.1.3儀器 LS-50B型熒光分光光度計(日本Shimadu公司)；IX-70型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國SHEL-LAB公司)；Model 3.9 EL酶標儀(Bio-Rad公司)。

1.2AGEs的體外制備配制0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)，然后將BSA(10 g·L-1)、D-羥乙醛(0.1 mol·L-1)、青鏈霉素(100 kU·L-1)分別溶于上述PBS中，充分搖勻，pH調至7.4，室溫下放置24 h；用0.22 μm針頭濾器過濾，滅菌、封口，置37℃恒溫箱避光孵育7 d后取出，再轉移至4 ℃冰箱無菌保存?zhèn)溆?。使用前，將制備的AGEs裝入透析袋，放入pH 7.4的無菌PBS透析液中，透析48 h，中途更換PBS液3～4次，除去未結合的D-羥乙醛，再次用0.22 μm針頭濾器過濾。取制備的樣品用熒光分光光度計鑒定，在激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長440 nm處釋放熒光。

1.3兔軟骨細胞體外培養(yǎng)將家兔麻醉后，在無菌條件下迅速取膝關節(jié)和髖關節(jié)處軟骨，用無菌PBS沖洗2～3遍后，將其剪成1～3 mm3碎塊，將所制軟骨碎塊轉移至25 mL無菌培養(yǎng)瓶內，加10 mL 0.2%的胰蛋白酶后，置37℃ CO2培養(yǎng)箱孵育,每隔15 min振蕩1次，45 min后取出，將胰蛋白酶棄去，加入10 mL 0.2% Ⅱ型膠原酶，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱孵育，每隔15 min振蕩1次，90 min后收集消化液，重復用0.2% Ⅱ型膠原酶直至所取軟骨碎片全部消化，最后收集的消化液用200目紗網(wǎng)過濾去除雜質，1 000 r·min-1離心10 min, 將下層的細胞層用配制好的DMEM培基稀釋后，按照2×105密度接種于培養(yǎng)瓶內，并加入15% 的FBS。3～5 d細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞80%融合后，開始鑒定并傳代，僅采用1～4代細胞用于實驗。

1.4細胞凋亡檢測將細胞種植蓋玻片后，置于6孔板內，細胞培養(yǎng)過夜；刺激細胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，在樣品中加100 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min后，PBS洗滌3次；用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為450 nm，發(fā)射波長為550 nm。

1.5ATP生成檢測細胞處理后吸除培養(yǎng)液，按6孔板每孔加200 μL比例加入裂解液，裂解后4℃ 12 000×g離心10 min，收集上清，BCA測定蛋白濃度。把ATP標準溶液用ATP檢測裂解液稀釋成適當?shù)臐舛忍荻葌溆?；按?6孔板每孔100 μL的體積配制適當量的ATP檢測液，每孔加入100 μL的ATP檢測液，室溫放置5 min，消耗掉本底ATP；每孔加入50 μL的標準品，輕輕搖晃均勻，立即在酶標儀檢測。

1.6線粒體跨膜電位(△Ψm)檢測將處理后細胞PBS漂洗2次，150 μL PBS重懸細胞，20 μL Rhodamine 123避光染色，37℃避光孵育30 min，熒光分光光度計激發(fā)波長507 nm，散發(fā)波長529 nm檢測。

1.7caspase-3活性檢測吸取細胞培養(yǎng)液，用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養(yǎng)液中，600×g4℃離心5 min收集細胞，小心吸除上清，PBS洗滌1次，吸盡上清后，按照每2×106個細胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4℃、20 000×g離心10～15 min后，放入試劑盒檢測體系中檢測。

1.8Real-timePCR采用TRIzol 法提取總RNA，取總RNA 5 μL，olig(dT)1 μL ，加DEPC水至12 μL，混勻，4 000 r·min-1離心5 s, 70℃孵育5 min后，于冰上冷卻5 min，再加入5×Buffer 4 μL，10 mmol·L-1dNTP 2 μL, 40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL, 加DEPC水處理到19 μL混勻，4 000 r·min-1離心5 s，37℃反應5 min，冰上驟冷5 min, 加入逆轉錄酶1 μL，總反應體系20 μL混勻，4 000 r·min-1離心5 s，之后于42℃反應60 min，72℃反應10 min，冰上驟冷結束反應。逆轉錄產物可以繼續(xù)進行PCR擴增。取PCR產物5 μL，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后攝片，用Imagemaster VDS圖像分析軟件測定產物條帶的積分光密度值。PPARγ 上游引物：5′-AGGAGCAGAGCAAAGAGGTGGC-3′，下游引物：5′-TGTGAGGACTCAGGGTGGTTCA-3′。 GAPDH上游引物：5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物：5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。

1.9PPARγ活性檢測采用基于ELISA 的DNA-binding 檢測試劑盒檢測PPARγ 活性。取10 μg核蛋白，加入事先包被有PPARγ特異性雙鏈DNA結合位點的96孔板上，4℃孵育過夜。結合的PPARγ經特異的PPARγ標記顯色后檢測。

1.10Westernblot提取總蛋白，并用牛血清白蛋白標準曲線調整為一致濃度后，溶解在10 g·L-1十二烷基硫酸鈉(SDS)中，每份樣品取8 μL進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。倒掉封閉液,用5%的脫脂奶粉按比例稀釋一抗，將膜置于一抗孵育液中，4℃搖動(20～30次/min)過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min。用5%的脫脂奶粉按一定比例稀釋二抗，將膜置于二抗孵育液中，室溫孵育1 h(20～30次/min)，用TBST洗膜4次，每次5 min。用ODYSSEY Fc imaging system顯色，拍照。數(shù)據(jù)用樣品與β-actin的比值表示。

Cur: Curcumin; Pio: Pioglitazone; CsA: Cyclosporine A.*P<0.05vscontrol;ΔP<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin;▲P<0.05vsAGEs+ Pioglitazone

2 結果

2.1AGEs對家兔軟骨細胞凋亡的影響及姜黃素的作用如Fig 1所示，AGEs (200 mg·L-1)孵育48 h后，可以明顯誘導兔軟骨細胞的凋亡；線粒體通透性轉換孔的抑制劑CsA(100 nmol·L-1)同樣可以明顯抑制AGEs誘導的細胞凋亡(P<0.05)。同時，PPARγ特異性激動劑吡格列酮(50 μmol·L-1)及50 μmol·L-1姜黃素均可以明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞凋亡；50 μmol·L-1姜黃素單獨處理組對軟骨細胞未見明顯代謝及功能影響[11]，而給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662 10 μmol·L-1預處理后，可以明顯拮抗姜黃素及吡格列酮對AGEs誘導軟骨細胞凋亡的保護作用。

2.2AGEs對家兔軟骨細胞線粒體功能的影響及姜黃素的作用如Fig 2所示，AGEs(200 mg·L-1)誘導軟骨細胞線粒體△Ψm及ATP合成明顯降低，姜黃素50 μmol·L-1及吡格列酮 50 μmol·L-1均可明顯抑制AGEs的損傷作用。GW9662 10 μmol·L-1預處理后，可以明顯拮抗姜黃素及吡格列酮對AGEs誘導的軟骨細胞線粒體△Ψm及ATP合成下降的保護作用。

Fig 2 Effect of curcumin on AGEs-induced mitochondrialfunction of chondrocytes (±s, n=8)

A: Effect of curcumin on AGEs-induced mitochondrial membrane potential ( △Ψm); B: Effect of curcumin on AGEs-induced mitochondrial ATP production.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin;▲P<0.05vsAGEs+Pioglitazone

Fig 3 Effect of curcumin on AGEs-induced expression ofcytochrome C (A), Bax and Bcl-2 (B), caspase-3(C) (±s, n=8)

*P<0.05vscontrol;ΔP<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin;▲P<0.05vsAGEs+ Pioglitazone

Fig 4 Effect of curcumin on AGEs-induced activity and

A: PPARγ activity；B: PPARγ protein level; C: PPARγ mRNA assayed by real-time PCR.*P<0.05vscontrol;ΔP<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin.

2.3AGEs對家兔軟骨細胞細胞色素C、caspase-3、Bax、Bcl-2表達的影響如Fig 3所示，與正常對照相比，AGEs (200 mg·L-1)能夠明顯誘導細胞色素C、caspase-3、Bax/Bcl-2比值增加，而姜黃素50 μmol·L-1及吡格列酮 50 μmol·L-1均可明顯抑制AGEs的上述作用；GW9662 10 μmol·L-1預處理后，可以明顯拮抗姜黃素及吡格列酮對AGEs誘導的細胞色素C表達、caspase-3活性、Bax/Bcl-2增加的抑制作用。

2.4AGEs對家兔軟骨細胞PPARγ表達的影響及姜黃素的作用如Fig 4所示，AGEs (200 mg·L-1)可以明顯誘導軟骨細胞PPARγ活性降低，同時伴隨PPARγ的mRNA及蛋白表達降低；50 μmol·L-1的姜黃素可以明顯上調PPARγ活性、mRNA及蛋白表達，同時，GW9662 10 μmol·L-1預處理1 h后，可以明顯抑制姜黃素的作用。

3 討論

本研究結果發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞凋亡及線粒體功能損傷，并明顯上調AGEs誘導的PPARγ活性的降低，伴隨PPARγ相應的mRNA及蛋白水平的升高，給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662預處理后，可以明顯拮抗姜黃素的保護作用。該結果表明，基于上調PPARγ的作用靶點，姜黃素可明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞線粒體損傷，進而抑制AGEs誘導的軟骨細胞凋亡。

在本研究中，為了探討線粒體損傷在AGEs致OA病變中的作用，我們直接使用外源性AGEs以排除體內其他因素的影響，發(fā)現(xiàn)AGEs可以使得軟骨細胞線粒體ATP生成減少，跨膜電位(△Ψm )降低，同時caspase-3活性增加，細胞色素C釋放增加，Bax/Bcl-2的比值增加。這些結果提示AGEs可以誘導線粒體功能損傷，從而導致細胞色素C釋放, Bax/Bcl-2的比值增加，激活caspase細胞凋亡途徑, 誘導軟骨細胞凋亡, 促進OA的發(fā)生發(fā)展。進一步的研究結果顯示，PPARγ特異性激動劑吡格列酮可以明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞線粒體功能損傷，而預先給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662可以明顯拮抗吡格列酮的作用。該結果提示，PPARγ的下調可能為AGEs誘導的線粒體功能損傷的重要機制之一。關于PPARγ對線粒體功能的調節(jié)作用的機制可能主要與PPARγ上調PGC-1α有關。PGC-1α與其下游的目標基因核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor 1，NRF-1)結合后可以調控線粒體轉錄，呼吸基因的調節(jié)，另外，還可以通過誘導線粒體脂肪酸和亞鐵血紅素生物合成途徑，提高線粒體的氧化功能[3, 8]。關于AGEs下調PPARγ 后，是否通過PGC-1α途徑誘導線粒體功能損傷，尚需進一步實驗證實。

為了進一步驗證基于PPARγ靶點的保護藥物是否對AGEs誘導的線粒體功能損傷具有保護作用，我們觀察了姜黃素對AGEs誘導軟骨細胞凋亡的作用。姜黃素已在多種細胞上被證實可以明顯上調PPARγ。文獻報道，在阿爾茨海默病大鼠模型中，姜黃素通過上調PPARγ明顯抑制β-淀粉樣蛋白誘導的神經炎癥[9]；Li等[10]研究表明，姜黃素通過提高PPARγ活性，抑制氧化應激，從而抑制血管緊張素II誘導的大鼠血管平滑肌細胞炎癥和增殖。關于姜黃素對PPARγ的上調作用機制尚不十分清楚，姜黃素或為PPARγ的天然配體，與PPARγ直接結合后激活PPARγ，或通過與體內某些受體結合后間接激活PPARγ，尚需要進一步的研究證實[11-12]。關于姜黃素對OA病變的保護作用已在OA患者或動物實驗中被證實，其可以有效緩解OA病變炎癥反應及疼痛等相關臨床癥狀[13-15]，而姜黃素是否通過基于PPARγ靶點發(fā)揮保護OA病變作用，尚不清楚。本研究結果顯示，姜黃素可以明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞凋亡及線粒體功能的損傷；而預先給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662處理后，可以有效拮抗姜黃素對AGEs誘導軟骨細胞凋亡及線粒體功能損傷的保護作用；同時，本研究進一步發(fā)現(xiàn)姜黃素可以明顯上調AGEs誘導的PPARγ活性的降低，伴隨PPARγ相應的mRNA及蛋白表達水平的升高。該研究結果提示，姜黃素上調PPARγ的活性及表達可能為姜黃素保護AGEs誘導軟骨細胞線粒體功能損傷的重要機制之一。

綜上，本研究表明，AGEs通過下調PPARγ誘導軟骨細胞線粒體功能損傷，從而激活caspase凋亡途徑，最終導致軟骨細胞凋亡，其中線粒體功能受損可能起了關鍵作用；同時，姜黃素基于PPARγ的作用靶點，有效保護AGEs誘導的軟骨細胞線粒體損傷，抑制軟骨細胞凋亡。另外，由于AGEs形式各異、分子量大、生成易分解難、體內不易清除等特點，使得PPARγ-線粒體損傷這一通路持續(xù)活化, 并且線粒體損傷后誘發(fā)大量ROS產生，又可反過來誘導AGEs特異性作用受體RAGE的表達，從而起到正反饋的作用，這或許可以解釋為什么OA患者的病變呈持續(xù)、進行性地發(fā)展。姜黃素來源方便、經濟，長期服用安全性高，多項臨床研究已證實其可有效減輕OA患者的病理生理進展及緩解疼痛，本研究結果將為姜黃素保護AGEs所致OA病變的發(fā)生發(fā)展提供新的實驗依據(jù)。

(致謝：本研究主要在甘肅省人民醫(yī)院科研中心完成，感謝課題組成員在本研究過程中提供幫助與指導。)

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