燈盞花乙素對(duì)J774A.1巨噬細(xì)胞中ATP誘導(dǎo)的炎癥小體活化和細(xì)胞焦亡的影響

景艷蕓，李陳廣，顏 亮，徐麗慧，白文靜，歐陽(yáng)東云，何賢輝

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 1. 免疫生物學(xué)系、2. 細(xì)胞生物學(xué)系，廣東 廣州 510632)

炎癥小體是存在于免疫細(xì)胞中的多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合體，可以感應(yīng)入侵的病原體或損傷組織釋放的危險(xiǎn)信號(hào)，在協(xié)助機(jī)體抵御病原體感染和組織損傷中發(fā)揮重要作用[1-2]。NLRP3(NOD-like receptor family，pyrin domain-containing 3)炎癥小體是目前研究最廣泛的炎癥小體之一，其活化一般需要兩個(gè)信號(hào)，第一信號(hào)是病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，如脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)被細(xì)胞膜模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)識(shí)別并結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)NLRP3、白細(xì)胞介素-1β前體(pro-interleukin-1β，pro-IL-1β)等炎癥性相關(guān)蛋白的表達(dá)；第二信號(hào)是損傷相關(guān)分子模式 (danger-associated molecular pattern，DAMP)如三磷酸腺苷(ATP)等激活NLRP3，通過(guò)接頭蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)，募集半胱天冬氨酸蛋白酶-1前體(pro-cysteinyl aspartate specific protease-1，pro-caspase-1)，進(jìn)而自我催化加工形成活化的caspase-1；活化的caspase-1切割pro-IL-1β形成成熟的IL-1β并分泌至細(xì)胞外，引起炎癥反應(yīng)[1, 3]。炎癥小體活化會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生炎癥性死亡——細(xì)胞焦亡(pyroptosis)。細(xì)胞焦亡是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種不同于細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的新型細(xì)胞死亡方式，它依賴于caspase-1活化，并通過(guò)切割gasdermin D (GSDMD)產(chǎn)生其N端產(chǎn)物(GSDMD-NT)，在細(xì)胞膜上成孔，使炎癥因子如成熟IL-1β、高速泳動(dòng)族框蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB1)等分泌至胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[4]。因此，正常的NLRP3炎癥小體的活化是機(jī)體固有免疫防線的重要組成部分，而NLRP3炎癥小體的異?；罨瘎t與多種炎癥性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是治療相關(guān)疾病的重要藥物靶標(biāo)[5-6]。

燈盞花乙素(scutellarin)又名野黃芩苷，是從燈盞花等中草藥中分離提取的一種黃酮類物質(zhì)，具有多種藥理學(xué)作用，如抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等[7]。在臨床上用于缺血和缺氧性心腦血管疾病的治療以及腦血管病后癱瘓的治療[8]。研究顯示，燈盞花乙素可以通過(guò)抑制鈣離子調(diào)節(jié)的鈣調(diào)磷酸酶和鈣蛋白激酶的信號(hào)通路，改善心腦血管疾病[9]。燈盞花乙素也具有明顯的抗炎作用，能抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路和炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減輕炎癥相關(guān)疾病的癥狀[10]。缺血性心腦血管疾病涉及組織損傷及損傷相關(guān)炎癥反應(yīng)，可能原因之一是損傷引起的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)(如ATP等)釋放到細(xì)胞外，激活固有免疫細(xì)胞中NLRP3活化和IL-1β等炎癥性細(xì)胞因子的分泌[11]。但目前燈盞花乙素對(duì)NLRP3炎癥小體活化的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，我們以LPS致敏的小鼠巨噬細(xì)胞 J774A.1作為炎癥細(xì)胞模型，探討燈盞花乙素對(duì)NLRP3炎癥小體活化和細(xì)胞焦亡的影響，為進(jìn)一步了解其藥理學(xué)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1細(xì)胞與試劑小鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)。燈盞花乙素購(gòu)于廣東省藥品檢驗(yàn)所；ATP、碘化丙錠(propidium iodide，PI)、Hoechst 33342、LPS、MDL12330A，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；DMEM、Opti-MEM、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素、鏈霉素為Thermo Fisher公司產(chǎn)品；抗caspase-1抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；抗NLRP3抗體購(gòu)于Adipogen AG公司；抗IL-1β、HMGB1、ASC、β-tubulin、phospho-(Ser/Thr) PKA substrate、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗等抗體以及Protein G agarose beads購(gòu)于Cell Signaling Technology公司；H89、PMSF購(gòu)自碧云天公司；Cytometric Bead Array (CBA) Mouse IL-1β Flex Set試劑盒為BD公司的產(chǎn)品。

1.2儀器Labofuge 400R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientifc公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Axio Observer D1倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；MINI Protean 2電泳系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad公司)；FluorChem 8000凝膠圖像成像儀(美國(guó)AlphaInnotech公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)小鼠J774A.1細(xì)胞為貼壁型細(xì)胞，培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(含10% FBS、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM)中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞焦亡的檢測(cè)參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，J774A.1細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，用0.5 mg·L-1LPS刺激4 h，加入燈盞花乙素(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)作用1 h，補(bǔ)加4 mmol·L-1的ATP反應(yīng)1 h，最后加入PI(2 mg·L-1)和Hoechst 33342(5 mg·L-1)室溫下孵育染色10 min，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)PI陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞(即Hoechst陽(yáng)性)的百分比。

2.3免疫印跡分析將J774A.1細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，用0.5 mg·L-1LPS刺激4 h，加入燈盞花乙素(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)作用1 h，補(bǔ)加4 mmol·L-1的ATP反應(yīng)1 h。分別提取細(xì)胞和上清中(樣品的體積相同)的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上。取出PVDF膜，加入適量的封閉液(含3% FBS和0.1% 吐溫20的PBST)，常溫下封閉1 h，然后加入相應(yīng)比例的一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育1 h。加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，成像儀拍照記錄結(jié)果，最后用Alpha EaseFC 4.0軟件(Alpha Innotech)分析條帶的灰度值。

2.4可溶性細(xì)胞因子IL-1β的檢測(cè)小鼠J774A.1細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，用0.5 mg·L-1LPS刺激4 h，加入燈盞花乙素(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)作用1 h，補(bǔ)加4 mmol·L-1的ATP反應(yīng)1 h。最后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說(shuō)明書定量檢測(cè)上清中IL-1β含量。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò)CellQuest軟件(BD公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析。

2.5cAMP-PKA信號(hào)通路的抑制小鼠J774A.1細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，用0.5 mg·L-1LPS刺激4 h，加入燈盞花乙素(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)作用30 min后，補(bǔ)加腺苷酸環(huán)化酶特異性抑制劑MDL12330A 10 μmol·L-1作用30 min，或者加入PKA的選擇性抑制劑H89 20 μmol·L-1作用30 min后，加燈盞花乙素(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)作用1 h，最后加入4 mmol·L-1的ATP反應(yīng)1 h。

3 結(jié)果

3.1燈盞花乙素抑制ATP誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化ATP是NLRP3炎癥小體的常用活化劑，而活化的caspase-1(10 ku)與成熟IL-1β(17 ku)是NLRP3炎癥小體活化的兩個(gè)重要標(biāo)志。免疫印跡檢測(cè)顯示，單獨(dú)LPS處理能夠促進(jìn)pro-IL-1β(31 ku)與NLRP3的表達(dá)，而對(duì)組成型表達(dá)的pro-caspase-1(45 ku)與ASC無(wú)影響(Fig 1A)；單獨(dú)LPS處理的巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中未檢測(cè)到活化的caspase-1p10與成熟的IL-1β(17 ku)的釋放。經(jīng)第二信號(hào)ATP刺激后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中能夠明顯檢測(cè)到活化的caspase-1p10以及成熟IL-1β(17 ku)(Fig 1A-1C)。而燈盞花乙素預(yù)處理能夠劑量依賴性地抑制ATP誘導(dǎo)的caspase-1活化以及IL-1β的成熟與分泌(Fig 1A-1C)；同時(shí)，LPS+燈盞花乙素處理并不會(huì)促進(jìn)caspase-1活化以及IL-1β的成熟與分泌(Fig 1A-1C)。另外，用 CBA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-1β的分泌水平，顯示燈盞花乙素能夠劑量依賴性地抑制ATP誘導(dǎo)的IL-1β的釋放(Fig 1D)，這與免疫印跡法的檢測(cè)結(jié)果相一致。這些結(jié)果表明，燈盞花乙素能夠抑制ATP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化。

3.2燈盞花乙素抑制巨噬細(xì)胞中ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡NLRP3炎癥小體活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生。而細(xì)胞焦亡可以通過(guò)PI染色法以及標(biāo)志性蛋白HMGB1的釋放進(jìn)行分析。如Fig 2所示，當(dāng)加入第二信號(hào)ATP后，細(xì)胞明顯變圓腫脹，甚至破裂成細(xì)胞碎片，從而使PI染料穿過(guò)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)出紅色熒光，表明ATP誘導(dǎo)LPS致敏的巨噬細(xì)胞發(fā)生了焦亡，其焦亡率約為45%(Fig 2A、2B)。而燈盞花乙素預(yù)處理能夠明顯抑制ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡(Fig 2A、2B)；單獨(dú)LPS或LPS+燈盞花乙素聯(lián)合作用并不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。免疫印跡法分析顯示，燈盞花乙素能夠劑量依賴性地抑制ATP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中HMGB1分泌至細(xì)胞培養(yǎng)上清中；然而在無(wú)ATP刺激時(shí)，單獨(dú)LPS或LPS+燈盞花乙素并不會(huì)導(dǎo)致HMGB1的釋放(Fig 2C、2D)。上述結(jié)果表明，在J774A.1細(xì)胞中，燈盞花乙素能夠抑制ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

3.3燈盞花乙素抑制巨噬細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡依賴于cAMP-PKA信號(hào)研究表明，燈盞花乙素可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平[13]，而cAMP能夠激活下游的PKA，活化的PKA可以負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體的活化[14]。因此，我們首先選用了腺苷酸環(huán)化酶特異性抑制劑MDL12330A抑制胞內(nèi)cAMP水平，以探討燈盞花乙素對(duì)細(xì)胞焦亡的影響。經(jīng)MDL12330A處理后，不僅能夠促進(jìn)ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，還能逆轉(zhuǎn)燈盞花乙素對(duì)巨噬細(xì)胞中ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的抑制作用(Fig 3A、3B)。以上結(jié)果提示，燈盞花乙素抑制巨噬細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡與cAMP水平密切相關(guān)。

進(jìn)一步利用PKA的選擇性抑制劑H89抑制PKA活性，通過(guò)PI染色法對(duì)細(xì)胞焦亡進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，燈盞花乙素預(yù)處理劑量依賴性地抑制J774A.1巨噬細(xì)胞中ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，而H89處理不僅能夠促進(jìn)ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，還能逆轉(zhuǎn)燈盞花乙素對(duì)ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡抑制作用(Fig 4A、4B)。上述結(jié)果提示，燈盞花乙素對(duì)NLRP3炎癥小體活化與細(xì)胞焦亡的抑制作用依賴于PKA信號(hào)。

Fig 1 Scutellarin inhibited ATP-induced activation of NLRP3 inflammasomes (±s, n=3)

A: Western blot analyses of the levels of indicated proteins in cell lysates and culture supernatants, respectively. β-tubulin was used as a loading control for cell lysates; B, C: Histograms showing the relative intensity of caspase-1p10 or IL-1β of Western blot. The intensity of caspase-1p10 or IL-1β bands in ATP group was set to 1.0; D: Cytometric bead array (CBA) assay for IL-1β levels in the culture supernatants.**P<0.01vsATP group. Scu: Scutellarin.

Fig2ScutellarininhibitedATP-inducedpyroptosisinJ774A.1macrophages

4 討論

NLRP3是固有免疫系統(tǒng)識(shí)別病原體的一類重要感受器,識(shí)別進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的PAMP或DAMP，從而引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)菌感染時(shí)，不僅細(xì)菌本身能釋放ATP，也能誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞釋放ATP，從而激活NLRP3炎癥小體，而引起急性期強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，并誘發(fā)固有免疫細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞)的焦亡；同樣，器官受到損傷時(shí)也能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DAMP(如ATP等)釋放到胞外，進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體和細(xì)胞焦亡，進(jìn)一步加強(qiáng)損傷相關(guān)的炎癥反應(yīng)。神經(jīng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展也與NLRP3有關(guān)，如多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病、帕金森病等[6]。此外，NLRP3的功能失調(diào)與多種代謝疾病和免疫紊亂(如2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、痛風(fēng)等)密切相關(guān)[6]。因此，抑制NLRP3炎癥小體的活化與細(xì)胞焦亡的發(fā)生，將有利于緩解上述NLRP3異?；罨嚓P(guān)炎癥性疾病的癥狀[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1中，燈盞花乙素處理可以抑制ATP誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化與細(xì)胞焦亡，從而抑制caspase-1的活化以及成熟IL-1β和HMGB1等炎癥因子的釋放，提示燈盞花乙素可作為一種治療NLRP3炎癥小體異?；罨嚓P(guān)的炎癥性疾病的潛在藥物。

由于NLRP3的活化能夠誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，因而受到多種調(diào)控分子或信號(hào)通路的調(diào)控。最近的研究發(fā)現(xiàn)，cAMP-PKA信號(hào)對(duì)NLRP3炎癥小體的活化也具有重要的調(diào)控作用。如膽汁酸通過(guò)其細(xì)胞膜受體TGR5提高胞內(nèi)cAMP水平，從而激活PKA，活化的PKA誘導(dǎo)NLRP3的Ser 291(小鼠)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而抑制NLRP3活化[14]；又如，前列腺素E2通過(guò)其受體EP4激活cAMP-PKA通路，促使NLRP3的Ser 295(人類)發(fā)生磷酸化，負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體活化[15]?？紤]到以往研究顯示燈盞花乙素可以上調(diào)cAMP的水平[13]，在本研究中我們初步探討了cAMP-PKA信號(hào)在燈盞花乙素抑制NLRP3炎癥小體活化與細(xì)胞焦亡過(guò)程中的作用，發(fā)現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶抑制劑MDL12330A和PKA抑制劑H89都能完全逆轉(zhuǎn)燈盞花乙素對(duì)ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的抑制作用，提示燈盞花乙素可能通過(guò)調(diào)節(jié)PKA的活性而抑制ATP誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化與細(xì)胞焦亡。

A: Cell death in J774A.1 cells was measured by staining with PI (red, staining dead cells) and Hoechst 33342 (blue, staining all cells). Scale bar=50 μm; B: PI-positive cells in five randomly chosen fields containing ～100 cells in each were quantified.**P<0.01vsvehicle; ns: not significant.

Fig4ScutellarininhibitedATP-inducedpyroptosisviaregulatingPKAsignaling

A: Cell death in J774A.1 cells was assayed by PI (red) and Hoechst 33342 (blue). Scale bars=50 μm; B: PI-positive cells in five randomly chosen fields containing ～100 cells in each were quantified.**P<0.01vsvehicle; ns: not significant.

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花乙素可以明顯抑制小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1中ATP誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化與細(xì)胞焦亡，這種抑制作用可能由cAMP/PKA信號(hào)通路所介導(dǎo)。雖然燈盞花乙素抑制NLRP3活化的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究闡明，本研究結(jié)果顯示燈盞花乙素可能用于預(yù)防和治療NLRP3異?；罨蚬δ苁д{(diào)所引起的炎癥性疾??；同時(shí)，這也為燈盞花乙素作為抗炎藥物發(fā)揮作用提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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