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    鐵必復(fù)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

    2018-01-24 11:44:32金麗蔡培培杭娟張心悅伍小勇張曉丹
    中國藥業(yè) 2018年1期
    關(guān)鍵詞:葛根素批號藥材

    金麗,蔡培培,杭娟,張心悅,伍小勇,張曉丹

    (中國人民解放軍南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所,江蘇南京210002)

    鐵必復(fù)顆粒為上海長征醫(yī)院自行研制的非標(biāo)準(zhǔn)復(fù)方制劑,由磁石、骨碎補(bǔ)、葛根、制大黃等11味中藥組方,具有益腎活血、清上鎮(zhèn)下的作用,臨床主要用于急性缺鐵性耳聾及與鐵代謝障礙相關(guān)的各類非感染性、非遺傳性感音神經(jīng)性病變或梅尼埃病引起的耳鳴、耳聾與眩暈等癥。為了更好地控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量,在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上,本研究中修訂了大黃、葛根和川芎的薄層色譜(TLC)法鑒別,并采用高效液相色譜(HPLC)法測定葛根中有效成分葛根素的含量,方法簡單、準(zhǔn)確,能有效控制該制劑的質(zhì)量?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 儀器與試藥

    儀器:島津LC-20AT型高效液相色譜儀,包括LC-20AT泵,LCsolution色譜工作站和SPD-M20A紫外檢測器(日本島津公司);MS105型電子天平(d=0.01mg),AL104型電子天平(d=0.1 mg),均購于Mettler Toledo公司;YOYO-ZS型紫外線分析攝影儀(武漢藥科新技術(shù)開始公司);KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);硅膠G板(青島海洋化工廠分廠,批號為20140608)。

    試藥:葛根對照藥材(批號為121551-201103),大黃對照藥材(批號為120984-201202),川芎對照藥材(批號為120918-201110),石菖蒲對照藥材(批號為121098-201105),葛根素對照品(純度為95.5%,批號為110715-201318),均購于中國食品藥品檢定研究院;鐵必復(fù)顆粒(批號分別為140310,140910,140922,規(guī)格為每袋12 g),陰性對照樣品,均由上海長征醫(yī)院提供;甲醇為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 定性鑒別(TLC法)

    大黃:取本品6 g,加甲醇25 mL,浸漬1 h,超聲30 min,放冷,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)?0 mL水使其溶解,加鹽酸2 mL,置水浴中加熱30 min后,立即冷卻,用乙醚振搖提取2次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,殘?jiān)右宜嵋阴? mL使其溶解,作為供試品溶液。取缺大黃的陰性樣品6 g,同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取大黃對照藥材0.1 g,同法制成對照藥材溶液。按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB中的TLC法試驗(yàn),吸取對照藥材溶液1 μL、供試品溶液10 μL和陰性對照品溶液10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30~60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中,在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上,顯相同橙黃色熒光斑點(diǎn);置氨蒸氣中熏后,日光下檢視,顯相同紅色斑點(diǎn),陰性對照無干擾。色譜見圖1 A。

    葛根:取本品6 g,加甲醇25 mL,浸漬1 h,超聲30 min,放冷,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使其溶解,加等量的正丁醇振搖提取2次,合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)蛹状? mL使其溶解,作為供試品溶液。取缺葛根陰性樣品6 g,同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取葛根對照藥材0.2 g,加甲醇10 mL,放置2 h,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?.5 mL使其溶解,作為對照藥材溶液。按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB中的TLC法試驗(yàn),吸取上述對照藥材溶液1 μL、供試品溶液5 μL和陰性對照品溶液5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水(2∶2∶4∶1)的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置氨蒸氣中熏15 min,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中,在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上。顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對照無干擾。見圖1 B。

    川芎:取本品24 g,研細(xì),加乙醚60 mL,超聲提取20 min,放冷,濾過,濾液揮干,殘?jiān)? mL乙酸乙酯使其溶解,作為供試品溶液。取缺川芎的陰性樣品,同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取川芎對照藥材0.1 g,加乙醚20 mL,同法制成對照藥材溶液。按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB中的TLC法試驗(yàn),吸取對照藥材溶液1 μL、供試品溶液15 μL和陰性對照溶液15 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中,在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 C。

    石菖蒲:取川芎鑒別項(xiàng)下供試品溶液。取缺石菖蒲的陰性樣品,按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取石菖蒲對照藥材0.5 g,加乙醚20 mL,同法制成對照藥材溶液。按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB中的TLC法試驗(yàn),吸取對照藥材溶液、供試品溶液各10 μL和陰性對照品溶液,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中,在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 D。

    圖1 薄層色譜圖

    2.2 含量測定(HPLC法)

    2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

    色譜柱:漢邦Lichrospher C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-水(25∶75);流速:1 mL/min;檢測波長:250 nm;柱溫:30℃。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

    2.2.2 溶液制備

    對照品貯備液:稱取葛根素對照品約12.5 mg,精密稱定,置50 mL容量瓶中,加50%甲醇使其溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

    對照品溶液:精密量取對照品貯備液3 mL,置10 mL容量瓶中,用50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

    供試品溶液:取裝量差異項(xiàng)下的本品,混勻,研細(xì),取約3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,加熱回流1 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    陰性對照品溶液:按處方比例稱取缺葛根的其余藥味,按鐵必復(fù)顆粒制備工藝制備陰性樣品,按供試品溶液制備方法制備溶液,即得。

    2.2.3 方法學(xué)考察

    專屬性試驗(yàn):取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各5 μL,按擬訂色譜條件進(jìn)行測定,其色譜圖見圖2??梢姡谂c對照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處有同一色譜峰,而陰性對照品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處則無此色譜峰出現(xiàn),表明鐵必復(fù)顆粒中其他成分對葛根素的測定無干擾。

    圖2 高效液相色譜圖

    線性關(guān)系考察:稱取葛根素對照品(純度為95.5%)約12.5 mg,精密稱定12.48 mg,置50 mL容量瓶中,加50%甲醇使其溶解,并稀釋至刻度,搖勻,作為葛根素對照品貯備液。分別精密量取葛根素貯備液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL,置10 mL容量瓶中,用50%甲醇稀釋至刻度,按擬訂色譜條件進(jìn)行測定,以質(zhì)量濃度(C,μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程A=21 113 C-3 620.6,r=1.000 0(n=6)。結(jié)果表明,葛根素質(zhì)量濃度在23.84~143.02 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

    精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為71.51 μg/mL的葛根素對照品溶液,依法連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積分別為1 563.1,1 539.3,1 539.2,1 541.5,1 540.4,1 544.6,RSD為0.60%(n=6),表明儀器精密度良好。

    穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一批(批號為140922)供試品,依法制備供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,10,12 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果葛根素峰面積分別為1 382.2,1 396.4,1 397.7,1 388.2,1 405.6,1 410.3,1 410.3,平均1 399,RSD為0.78%(n=6),表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取同一批(批號為140922)樣品6份,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,記錄葛根素峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果含量分別為1.082 5,1.098 9,1.098 7,1.092 1,1.087 6,1.0958 mg/g,平均1.0926 mg/g,RSD為0.59%(n=6),表明該方法的重復(fù)性良好。

    加樣回收試驗(yàn):稱取同一(批號為140922,葛根素含量為1.092 6 mg/g)樣品6份,各約1.5 g,精密稱定,分別加入質(zhì)量濃度為0.1596 g/L的對照品溶液(精密稱取葛根素對照品16.71 mg,置100 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得)10 mL,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,記錄葛根素峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算含量(mg)。結(jié)果見表1。

    2.2.4 樣品含量測定

    分別稱取3批樣品約3 g,依法制備供試品溶液,擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,記錄葛根素峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

    表1 葛根素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    表2 鐵必復(fù)顆粒含量測定結(jié)果

    2.2.5 耐用性試驗(yàn)

    流動相比例:取樣品(批號為140922),依法制備供試品溶液,調(diào)節(jié)流動相比例,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,記錄葛根素的峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g),結(jié)果見表3。結(jié)果表明,流動相中甲醇的比例增大對含量測定結(jié)果影響相對更大些,但基本能剛好滿足樣品檢測的要求。

    表3 不同流動相比例試驗(yàn)結(jié)果

    色譜柱:取樣品(批號為140922),使用不同品牌的色譜柱,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,記錄葛根素峰的面積,按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g),結(jié)果見表4。結(jié)果表明,不同色譜柱對含量測定結(jié)果影響很小。

    表4 不同色譜柱試驗(yàn)結(jié)果

    柱溫:取樣品(批號為140922),在不同柱溫下,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,記錄葛根素的峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g),結(jié)果見表5。結(jié)果表明,不同柱溫對含量測定結(jié)果影響很小。

    表5 不同柱溫試驗(yàn)結(jié)果

    流速考察:取樣品(批號為140922),在不同流速下,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定,記錄葛根素峰的面積,按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g),結(jié)果見表6。結(jié)果表明,不同流速對含量測定結(jié)果影響很小。

    表6 不同流速試驗(yàn)結(jié)果

    3 討論

    3.1 流動相選擇

    [1-7],對甲醇-水和乙腈-水2種流動相體系及比例進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)在甲醇-水(25∶75)和乙腈-水(11∶89)條件下,供試品溶液中葛根素的出峰時(shí)間和分離效果都很好,可滿足檢測要求。考慮溶劑的毒性與檢測成本,選擇甲醇-水(25∶75)為流動相。

    3.2 提取方法及試驗(yàn)條件選擇

    按L9(34)正交表設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn),考察了4個(gè)因素,包括提取方法(超聲、加熱回流、振搖),溶劑種類(50%甲醇、稀乙醇、30%乙醇),溶劑量(40,50,60 mL),提取時(shí)間(30,60,90 min)對提取效率的影響。結(jié)果表明,最佳提取條件為以60 mL 50%甲醇為提取溶劑,加熱回流提取1 h。用50%甲醇以加熱回流提取樣品,考察了50 mL和60 mL溶劑量對提取效率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2次提取的相對平均偏差均小于1.0%,表明溶劑量對提取效率的影響不顯著。因此,考慮到加入溶劑的準(zhǔn)確性,選擇溶劑量為50 mL。

    參考文獻(xiàn):

    [1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄ⅥB,151,282.

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    [3]李媛,李強(qiáng).HLPC法測定感冒止咳顆粒中葛根素的含量[J].藥學(xué)研究,2015,34(1):13-15.

    [4]李翔,劉皈陽,馬建麗,等.高效液相色譜法測定葛根姜黃口服液中葛根素的含量[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2014,26(6):97-98.

    [5]李曉娟.反相高效液相色譜法測定護(hù)肝膠囊中葛根素含量[J].中國藥業(yè),2014,23(23):53-55.

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    [7]陳敏,王青華,顧琳娜.HPLC法測定感冒退燒片中葛根素的含量[J].浙江中醫(yī)雜志,2014,49(2):150-151.

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