鐵必復(fù)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

金麗，蔡培培，杭娟，張心悅，伍小勇，張曉丹

（中國人民解放軍南京軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，江蘇南京210002）

鐵必復(fù)顆粒為上海長征醫(yī)院自行研制的非標(biāo)準(zhǔn)復(fù)方制劑，由磁石、骨碎補(bǔ)、葛根、制大黃等11味中藥組方，具有益腎活血、清上鎮(zhèn)下的作用，臨床主要用于急性缺鐵性耳聾及與鐵代謝障礙相關(guān)的各類非感染性、非遺傳性感音神經(jīng)性病變或梅尼埃病引起的耳鳴、耳聾與眩暈等癥。為了更好地控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，本研究中修訂了大黃、葛根和川芎的薄層色譜（TLC）法鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法測定葛根中有效成分葛根素的含量，方法簡單、準(zhǔn)確，能有效控制該制劑的質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：島津LC－20AT型高效液相色譜儀，包括LC－20AT泵，LCsolution色譜工作站和SPD－M20A紫外檢測器（日本島津公司）；MS105型電子天平（d＝0.01mg），AL104型電子天平（d＝0.1 mg），均購于Mettler Toledo公司；YOYO－ZS型紫外線分析攝影儀（武漢藥科新技術(shù)開始公司）；KQ－250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠，批號為20140608）。

試藥：葛根對照藥材（批號為121551－201103），大黃對照藥材（批號為120984－201202），川芎對照藥材（批號為120918－201110），石菖蒲對照藥材（批號為121098－201105），葛根素對照品（純度為95.5%，批號為110715－201318），均購于中國食品藥品檢定研究院；鐵必復(fù)顆粒（批號分別為140310，140910，140922，規(guī)格為每袋12 g），陰性對照樣品，均由上海長征醫(yī)院提供；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別(TLC法)

大黃：取本品6 g，加甲醇25 mL，浸漬1 h，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水使其溶解，加鹽酸2 mL，置水浴中加熱30 min后，立即冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使其溶解，作為供試品溶液。取缺大黃的陰性樣品6 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取大黃對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB中的TLC法試驗(yàn)，吸取對照藥材溶液1 μL、供試品溶液10 μL和陰性對照品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同橙黃色熒光斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，顯相同紅色斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。色譜見圖1 A。

葛根：取本品6 g，加甲醇25 mL，浸漬1 h，超聲30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使其溶解，加等量的正丁醇振搖提取2次，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使其溶解，作為供試品溶液。取缺葛根陰性樣品6 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取葛根對照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，放置2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使其溶解，作為對照藥材溶液。按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB中的TLC法試驗(yàn)，吸取上述對照藥材溶液1 μL、供試品溶液5 μL和陰性對照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯－水（2∶2∶4∶1）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏15 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上。顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖1 B。

川芎：取本品24 g，研細(xì)，加乙醚60 mL，超聲提取20 min，放冷，濾過，濾液揮干，殘?jiān)? mL乙酸乙酯使其溶解，作為供試品溶液。取缺川芎的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取川芎對照藥材0.1 g，加乙醚20 mL，同法制成對照藥材溶液。按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB中的TLC法試驗(yàn)，吸取對照藥材溶液1 μL、供試品溶液15 μL和陰性對照溶液15 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 C。

石菖蒲：取川芎鑒別項(xiàng)下供試品溶液。取缺石菖蒲的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取石菖蒲對照藥材0.5 g，加乙醚20 mL，同法制成對照藥材溶液。按2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB中的TLC法試驗(yàn)，吸取對照藥材溶液、供試品溶液各10 μL和陰性對照品溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）－乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 D。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測定(HPLC法)

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：漢邦Lichrospher C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－水（25∶75）；流速：1 mL／min；檢測波長：250 nm；柱溫:30℃。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

2.2.2 溶液制備

對照品貯備液:稱取葛根素對照品約12.5 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液：精密量取對照品貯備液3 mL，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取裝量差異項(xiàng)下的本品，混勻，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例稱取缺葛根的其余藥味，按鐵必復(fù)顆粒制備工藝制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)行測定，其色譜圖見圖2?？梢姡谂c對照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處有同一色譜峰，而陰性對照品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處則無此色譜峰出現(xiàn)，表明鐵必復(fù)顆粒中其他成分對葛根素的測定無干擾。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：稱取葛根素對照品（純度為95.5%）約12.5 mg，精密稱定12.48 mg，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為葛根素對照品貯備液。分別精密量取葛根素貯備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，按擬訂色譜條件進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度（C，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A＝21 113 C－3 620.6，r＝1.000 0（n＝6）。結(jié)果表明，葛根素質(zhì)量濃度在23.84～143.02 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為71.51 μg／mL的葛根素對照品溶液，依法連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積分別為1 563.1，1 539.3，1 539.2，1 541.5，1 540.4，1 544.6，RSD為0.60%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為140922）供試品，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果葛根素峰面積分別為1 382.2，1 396.4，1 397.7，1 388.2，1 405.6，1 410.3，1 410.3，平均1 399，RSD為0.78%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批（批號為140922）樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果含量分別為1.082 5，1.098 9，1.098 7，1.092 1，1.087 6，1.0958 mg／g，平均1.0926 mg／g，RSD為0.59%（n＝6），表明該方法的重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取同一（批號為140922，葛根素含量為1.092 6 mg／g）樣品6份，各約1.5 g，精密稱定，分別加入質(zhì)量濃度為0.1596 g／L的對照品溶液（精密稱取葛根素對照品16.71 mg，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得）10 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量（mg）。結(jié)果見表1。

2.2.4 樣品含量測定

分別稱取3批樣品約3 g，依法制備供試品溶液，擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表1 葛根素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 鐵必復(fù)顆粒含量測定結(jié)果

2.2.5 耐用性試驗(yàn)

流動相比例：取樣品（批號為140922），依法制備供試品溶液，調(diào)節(jié)流動相比例，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄葛根素的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量（mg／g），結(jié)果見表3。結(jié)果表明，流動相中甲醇的比例增大對含量測定結(jié)果影響相對更大些，但基本能剛好滿足樣品檢測的要求。

表3 不同流動相比例試驗(yàn)結(jié)果

色譜柱：取樣品（批號為140922），使用不同品牌的色譜柱，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄葛根素峰的面積，按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量（mg／g），結(jié)果見表4。結(jié)果表明，不同色譜柱對含量測定結(jié)果影響很小。

表4 不同色譜柱試驗(yàn)結(jié)果

柱溫：取樣品（批號為140922），在不同柱溫下，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄葛根素的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量（mg／g），結(jié)果見表5。結(jié)果表明，不同柱溫對含量測定結(jié)果影響很小。

表5 不同柱溫試驗(yàn)結(jié)果

流速考察：取樣品（批號為140922），在不同流速下，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄葛根素峰的面積，按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量（mg／g），結(jié)果見表6。結(jié)果表明，不同流速對含量測定結(jié)果影響很小。

表6 不同流速試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 流動相選擇

[1－7]，對甲醇－水和乙腈－水2種流動相體系及比例進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)在甲醇－水（25∶75）和乙腈－水（11∶89）條件下，供試品溶液中葛根素的出峰時(shí)間和分離效果都很好，可滿足檢測要求。考慮溶劑的毒性與檢測成本，選擇甲醇－水（25∶75）為流動相。

3.2 提取方法及試驗(yàn)條件選擇

按L9（34）正交表設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，考察了4個(gè)因素，包括提取方法（超聲、加熱回流、振搖），溶劑種類（50%甲醇、稀乙醇、30%乙醇），溶劑量（40，50，60 mL），提取時(shí)間（30，60，90 min）對提取效率的影響。結(jié)果表明，最佳提取條件為以60 mL 50%甲醇為提取溶劑，加熱回流提取1 h。用50%甲醇以加熱回流提取樣品，考察了50 mL和60 mL溶劑量對提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2次提取的相對平均偏差均小于1.0%，表明溶劑量對提取效率的影響不顯著。因此，考慮到加入溶劑的準(zhǔn)確性，選擇溶劑量為50 mL。

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