膀胱癌的超聲分子影像學(xué)研究進展

劉敏薇，徐盼，周愛云

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，江西南昌 330006；

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)居常見腫瘤發(fā)病率第9位，病死率居第13位[1]，根據(jù)浸潤深度，70%的膀胱癌為非肌層浸潤性膀胱癌，包括原位癌、Ta、T1期膀胱癌；30%為肌層浸潤性膀胱癌，包括T2～4期膀胱癌[2-3]。盡管非肌層浸潤性膀胱癌不易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，但90%的非肌層浸潤性膀胱癌患者手術(shù)后仍會復(fù)發(fā)，且25%的非肌層浸潤性膀胱癌會進展為肌層浸潤性膀胱癌[4]，故仍需要密切行實驗室檢查及影像學(xué)檢查監(jiān)測患者的病情變化。超聲分子影像學(xué)是目前醫(yī)學(xué)影像學(xué)研究的熱點之一，能夠無創(chuàng)、實時、早期診斷、動態(tài)觀察病灶變化等，可以用于早期診斷、評估病情和特異性治療等。超聲分子影像的發(fā)展對膀胱癌的診斷、病情監(jiān)測和治療具有重要臨床意義。

1 膀胱癌的診斷及治療

膀胱鏡檢查是目前臨床上用于診斷膀胱癌的技術(shù)，包括白光、窄譜及熒光膀胱鏡檢查等。然而，白光膀胱鏡容易忽略扁平的高分化腫瘤（如原位癌），難以辨別腫瘤的良惡性[5]。窄譜膀胱鏡是在普通內(nèi)鏡光源處應(yīng)用特殊的光學(xué)濾鏡濾掉紅光，將光源的波長限制在415～540 nm，增強藍光和綠光的強度，從而提高對膀胱富血管腫瘤組織的顯像[6]。窄譜膀胱鏡比傳統(tǒng)膀胱鏡能清晰地顯示腫瘤邊緣，使得腫瘤更容易切除，但其檢測假陽性率較高。熒光膀胱鏡又稱為藍光膀胱鏡，是利用光敏劑使腫瘤組織選擇性吸收，在藍光（波長380～480 nm）的激光照射下，光敏劑發(fā)生一系列光化學(xué)反應(yīng)和光生物學(xué)反應(yīng)，發(fā)射出紅色的熒光，從而在藍色背景下區(qū)別正常組織和腫瘤組織[7]。熒光成像對淺表組織具有高靈敏度，但其空間分辨率低、組織穿透性差，且目前大多數(shù)熒光示蹤劑缺少分子特異性。尿液細胞學(xué)化學(xué)篩檢是膀胱腫瘤診斷的“金標準”之一，但尿液檢查易受尿路因素的影響，誤診率高。

經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（TURBt）是治療淺表性膀胱癌（非肌層浸潤性膀胱癌）的“金標準”，而肌層浸潤性膀胱癌較常見的治療方法包括膀胱根治性切除術(shù)、新輔助化療和放化療[3]。根治性切除術(shù)會給患者帶來不可逆的損傷，因此國際上部分醫(yī)療機構(gòu)推薦使用化療和放療或聯(lián)合療法，既可以保存膀胱，也為無法行手術(shù)治療的患者提供了一種可選擇的治療手段[8]。此外，為了防止腫瘤復(fù)發(fā)，術(shù)后常聯(lián)合吡柔比星、絲裂霉素、阿霉素、舒尼替尼、卡介苗等對膀胱癌患者進行膀胱灌注治療。膀胱灌注治療是膀胱癌治療的一大特點，它可使藥物易于與病灶直接接觸，尤其是對淺表性膀胱癌有較好的治療效果。隨著灌注藥物，特別是靶向藥物的深入研究，超聲分子影像學(xué)在膀胱癌診斷及治療中的運用也得到越來越多的關(guān)注。

2 超聲分子影像

分子影像學(xué)是傳統(tǒng)影像學(xué)與分子學(xué)相融合的交叉學(xué)科，通過傳統(tǒng)影像學(xué)方法對細胞水平或分子水平的生物過程進行定量或定性分析，可以直接、間接記錄和觀察在發(fā)生生物事件時，細胞及分子在空間和時間上的分布情況[9]。超聲分子影像學(xué)以靶向超聲造影劑為探針，具有以下功能：①能夠在分子水平無創(chuàng)性地顯示炎癥、血栓、腫瘤的血管形成；②可將基因表達、生物信號傳遞等復(fù)雜的過程變成直觀的圖像；③使臨床更好地在分子水平了解疾病的發(fā)生機制及特征；④能夠發(fā)現(xiàn)疾病早期的分子變異及病理改變過程；⑤可在活體連續(xù)觀察藥物或基因治療的機制、效果等。目前新型的靶向超聲造影劑包括納米級超聲造影劑、多模態(tài)超聲造影劑、相變超聲造影劑等。關(guān)于分子靶向超聲造影劑的應(yīng)用，既往研究證實其在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等的診斷中均有重要作用[8,10-11]。Willmann等[12]首次將血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）靶向造影劑BR55運用于21例乳腺癌患者及24例卵巢癌患者，獲得卵巢癌及乳腺癌患者病灶的KDR（VEGFR-2）表達情況，并將病灶免疫組化染色所得 KDR表達作為“金標準”與血管靶向造影劑BR55獲得的表達水平進行比較，結(jié)果表明，乳腺癌患者靶向造影劑獲得的KDR表達水平與其病理免疫組化結(jié)果吻合度為93%，卵巢癌患者中兩者吻合度為85%，研究監(jiān)測患者血壓、心電圖、心率等均未出現(xiàn)異常，證明該靶向造影劑安全、可行。從動物實驗到第一次運用于人體病灶，該實驗結(jié)果表明超聲分子影像學(xué)將是一個辨別良惡性病灶的理想檢查方法，能夠減少一些不必要的組織活檢及手術(shù)。

3 超聲分子影像在膀胱癌中的應(yīng)用

3.1 血管生成相關(guān)標志物靶向造影劑在膀胱癌診斷及治療中的運用 新生血管是腫瘤獲得血液供應(yīng)的唯一途徑，其與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[13]。腫瘤新生血管是反映腫瘤分級、侵襲性及預(yù)后的重要標準。而腫瘤組織的微血管密度水平與其大小、是否形成癌栓及與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。免疫組化是目前測量腫瘤微血管密度的常用方法，但通過該方法測得的數(shù)據(jù)僅能提供一個時間點的腫瘤組織微血管密度水平，并非實時、動態(tài)。前期研究通過免疫組化分別測得高級別膀胱尿路上皮癌患者與低級別膀胱尿路上皮癌患者腫瘤組織的微血管密度，發(fā)現(xiàn)膀胱癌病理級別越高，微血管密度越大[14]，提示膀胱腫瘤生長、轉(zhuǎn)移均與新生血管有關(guān)。大量的蛋白質(zhì)和酶均參與了腫瘤新生血管的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如VEGFR-2、整合素avβ3、P-選擇素、血管細胞黏附因子-1（VCAM-1）等。Coskun等[15]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者血清中P-選擇素、可溶性血管細胞黏附因子-1（s-VCAM-1）及可溶性細胞間黏附因子-1水平顯著高于正常人，且肌肉浸潤性膀胱癌患者血清s-VCAM-1水平高于淺表性膀胱癌患者，提示在膀胱癌患者中，參與新生血管信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的P-選擇素、VCAM-1等表達水平升高。Chan等[16]將生物素化的抗 VEGFR-2單克隆抗體與聲學(xué)性能良好的微泡結(jié)合形成血管靶向造影劑，將造影劑由眶后靜脈注入原位膀胱癌的小鼠模型體內(nèi)，然后運用數(shù)字減影技術(shù)依次測得注入造影劑前后的超聲圖像強度，以及低頻脈沖波爆破造影劑前后超聲圖像強度，通過計算各圖像強度的改變量化小鼠膀胱癌血管表面 VEGFR-2的表達情況（即以爆破靶向造影劑前后超聲圖像強度差值代表VEGFR-2的表達）。實驗結(jié)果表明，在小鼠腫瘤種植第 14天和第 21天，代表VEGFR-2表達水平的平均圖像信號強度由 7.15±7.51上升至32.95±21.01，其圖像強度改變差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006），表明隨著腫瘤生長，其VEGFR-2表達水平升高，提示血管靶向造影劑能與膀胱腫瘤有效結(jié)合，為實現(xiàn)實時準確地監(jiān)測膀胱癌的微血管變化奠定了理論基礎(chǔ)。高渝等[17]利用超聲微泡造影劑介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）轉(zhuǎn)染作用于人膀胱癌裸鼠移植瘤模型（即UM+ASODN組），與注射微泡造影劑（UM組）及生理鹽水（單純組）對照，發(fā)現(xiàn)UM+ASODN組抑瘤率為67.22%，與對照組抑瘤率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其實驗結(jié)果證明微泡介導(dǎo)的 VEGF反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染能有效抑制膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的生長，表明抑制膀胱癌組織中血管生長因子的表達能抑制腫瘤新生血管生成，進而有效抑制膀胱腫瘤的生長，是評價抗血管生成藥物對腫瘤的療效提供直接、無創(chuàng)的潛在檢測及治療技術(shù)。

3.2 腫瘤導(dǎo)向肽靶向造影劑及其載藥后運用于膀胱癌細胞及活體實驗的研究 目前大多數(shù)抗腫瘤藥物無靶向性，容易引起患者全身毒性反應(yīng)和不良副作用。大量研究擬尋找能夠與腫瘤細胞或腫瘤血管特異性結(jié)合的相關(guān)肽段，引起學(xué)者對腫瘤導(dǎo)向肽的關(guān)注[18]。目前已確認的膀胱癌導(dǎo)向肽包括多肽序列（CSNRDARRC）、NYZL1及PLZ4。Smith[19]于1985年報道了外源多肽在單鏈噬菌體表面呈現(xiàn)的結(jié)果，噬菌體展示文庫技術(shù)隨之在國內(nèi)發(fā)展起來。Lee等[20]利用噬菌體展示文庫技術(shù)首次成功篩選提取到特異性高度結(jié)合膀胱腫瘤HT-1376細胞株的小分子多肽序列（CSNRDARRC）；隨后，羅俊西等[21]采用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選得到人膀胱癌 BIU87的特異性靶向多肽標志物（CSSPIGRHC），并命名為NYZL1。隨著納米微泡制作技術(shù)及膀胱腫瘤導(dǎo)向肽的研究日益成熟，蘇西西等[22]利用機械振動法制備普通脂性納米微泡，用生物素-親和素橋接法將生物素-分子導(dǎo)向肽 NYZL1連接到納米微泡表面，制備出具有靶向特異性結(jié)合的膀胱癌BIU-87癌細胞的新型造影劑，通過體外超聲影像設(shè)備發(fā)現(xiàn)該靶向造影劑能夠在體外與膀胱癌 BIU-87細胞特異性結(jié)合。潘佐[23]也得出同樣結(jié)論，且進一步將脂性微泡與標記了熒光探針的 NYZL1導(dǎo)向肽結(jié)合運用于裸鼠實驗，通過活體熒光分子成像儀觀察到靶向微泡能與膀胱異體種植的腫瘤特異性結(jié)合，為未來的膀胱癌早期診斷提供了理論依據(jù)。Zhang等[24]采用一株一肽法制備了膀胱癌導(dǎo)向肽PLZ4，并證明其能與5種來源于人類患者原發(fā)性膀胱癌細胞結(jié)合，尤其與人膀胱癌細胞系 5637結(jié)合能力最強，而不與正常的尿路上皮細胞結(jié)合。同時，該研究收集正在接受卡介苗灌注治療患者的尿液，在pH為6的尿液環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)PLZ4能與尿液中的膀胱癌細胞結(jié)合而不與尿液中的非腫瘤細胞結(jié)合。Pan等[25]將膀胱癌導(dǎo)向肽PLZ4與納米聚合物膠體束結(jié)合并通過蒸發(fā)法將抗腫瘤藥物紫杉醇載入納米膠體束核心，稱為DC-PNM-PTX。該研究發(fā)現(xiàn)，DC-PNM-PTX能夠穩(wěn)定地存在于十二烷基磺酸鈉中，易溶解于加有谷胱甘肽的溶液。通過靜脈給藥，發(fā)現(xiàn) DC-PNM-PTX能夠特異性地結(jié)合來源于人類膀胱腫瘤細胞異體種植于裸鼠的膀胱腫瘤，而不與異體種植的肺部腫瘤結(jié)合。同時實驗證明通過DCPNM-PTX給藥能將種植膀胱癌的裸鼠生存天數(shù)從非靶向給藥生存的55 d延長至69.5 d。Lin等[26]將PLZ4運用于膀胱癌的光動力學(xué)診斷及治療，將光敏劑鮑光過敏素結(jié)合納米膠體束，又將PLZ4與納米膠體束結(jié)合，再將兩者結(jié)合使其形成具有靶向功能及光動力學(xué)診斷/治療的納米級光學(xué)造影劑（PNPs），將其放入混有來自人體的膀胱癌細胞系 5637與正常的尿路上皮細胞的培養(yǎng)皿中，發(fā)現(xiàn) PNPs能與人膀胱癌細胞系5637特異性結(jié)合，與正常的尿路上皮細胞不結(jié)合。同樣，該研究還將納米膠束與阿霉素結(jié)合，形成 PNPDOX，發(fā)現(xiàn)其藥效釋放較普通阿霉素更持久。導(dǎo)向肽作為特異性結(jié)合膀胱腫瘤的標志物，其分子量小于抗體，因而不易引起人體的免疫排斥反應(yīng)，更易進入腫瘤組織，使其結(jié)合的藥物藥效更持久，且患者耐受性好[27]，而且腫瘤導(dǎo)向肽通過科技技術(shù)自動合成，價格更加實惠，為日后成為臨床常用的診斷及治療手段提供可能。

綜上所述，膀胱尿路上皮相關(guān)特異性表達的標志物還包括尿路上皮特異蛋白II、S蛋白100P等[28-29]，未來將有潛力運用于膀胱癌靶向造影劑的研究。血管靶向造影劑BR55作為臨床實驗的新藥已經(jīng)獲得了美國食品和藥物管理局的批準，將運用于下一步臨床試驗。導(dǎo)向肽介導(dǎo)的靶向納米微泡能特異性地結(jié)合膀胱腫瘤，而幾乎不與其他腫瘤或器官結(jié)合，使膀胱癌的診斷及治療真正達到“專一”的靶向效果，其分子量小，結(jié)合力強，不易被體內(nèi)的吞噬系統(tǒng)清除，這使得導(dǎo)向肽有可能成為未來膀胱癌精準診療的重要小分子載體。超聲分子影像學(xué)的優(yōu)勢在于利用膀胱癌相關(guān)的標志物示蹤，提高早期診斷率、提供病情發(fā)展動態(tài)情況、降低非靶向治療中帶來的副作用及不良毒性反應(yīng)等。隨著超聲分子影像學(xué)的快速發(fā)展，膀胱癌的早期診斷、精準治療也將不斷提高。