Wnt/Ca2+信號通路在肢體缺血/再灌注損傷機制中的研究進展

申 震,朱付平，黃 勇，范儀銘，周富強,潘成熙

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410007；2.河南省洛陽正骨醫(yī)院骨科，河南 洛陽 471000)

肢體缺血/再灌注損傷(limb ischemia/reperfusion injury，LIRI)是指組織器官缺血一段時間后，重新恢復血流灌注時組織器官的損傷程度不但沒有減輕反而較缺血時不斷加重，機體功能進一步惡化的綜合征，是一種臨床上常見的多發(fā)生于嚴重創(chuàng)傷后的復雜病理過程[1]。LIRI的病理機制至今仍未完全闡明，目前醫(yī)學界多認為其與脂質過氧化及氧自由基損傷、鈣離子代謝紊亂、細胞凋亡、炎癥反應損害等有關[2-3]。LIRI不僅可損傷局部組織，而且可以影響到遠隔內臟器官。在經過肢體缺血預處理后，可以減輕遠隔的心、肝、腎、腦等內臟器官的缺血/再灌注損傷程度[4-5]。如果沒有及時有效地防治LIRI，肢體局部骨骼肌就會出現纖維化和攣縮等病理改變，逐漸影響肢體的正常功能，嚴重者導致肢體缺血性壞死面臨截肢的風險，甚至引起全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的發(fā)生，導致多器官的功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，對患者預后及生活質量產生嚴重影響[6]。隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，近年來國內外專家學者對LIRI病理機制研

究及防治的重心已轉移至分子機制和信號因子靶向調控方面。鈣調蛋白(calmodulin，CaM)介導的Ca2+超載及機體炎癥反應所導致的缺血/再灌注損傷已被醫(yī)學界所公認，且Wnt/Ca2+信號通路可誘使細胞內Ca2+濃度升高，并可活化Ca2+敏感信號成分，激活三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)、鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKⅡ)以及其他轉錄因子，在Ca2+代謝及機體炎癥反應中起著重要作用[7-8]。本文就Wnt/Ca2+信號通路在LIRI機制中所起的作用進行綜述。

1 Wnt與Wnt/Ca2+信號通路

Wnt信號通路是一條繁雜的信號網絡，在機體生長、發(fā)育、代謝、免疫、應激等多種生物過程中發(fā)揮著重要作用，而Wnt信號通路的調控異常與細胞凋亡、炎癥及許多疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸有著密切聯系[9]。人類有19個激活不同Wnt信號通路途徑，并與Wnt調節(jié)不同生物過程特異性受體結合的Wnt配體[10]，而Wnt信號通路包括經典通路和非經典通路。目前研究認為至少包括以下4條分支：① Wnt/β-catenin通路，屬于Wnt的經典通路，激活Wnt/β-catenin通路可引起細胞質內的β-catenin處于穩(wěn)定狀態(tài)，其胞內濃度上升，信號轉導因子β-catenin進入細胞核內激活靶基因，從而發(fā)揮調節(jié)作用；② Wnt/PCP通路，即平板細胞極性通路，與細胞極性密切相關；③ Wnt/Ca2+通路，主要通過誘使細胞內Ca2+濃度不斷上升和Ca2+相關敏感信號傳導因子活化，從而發(fā)揮調節(jié)細胞活力和細胞黏附、運動的作用；④ 調節(jié)紡錘體的方向和非對稱細胞分裂的胞內通路，該通路目前研究較少。

Wnt/Ca2+信號通路由Wnt配體、卷曲蛋白(frizzled protein,Fz)受體、G蛋白、散亂蛋白(dishevelled，DVL)、磷脂酶C(phospholipase C,PLC)、IP3、二?；视?diacylglycerol，DAG)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、CaM、CaMKⅡ等成分構成，通路主要由Wnt5a和Wnt11激活。當Wnt信號與胞膜上Fz受體結合時，可通過活化的G蛋白和DVL激活PLC，活化的PLC可水解膜磷脂(membrane phospholipid，PIP2)，并生成IP3和DAG，IP3可促使胞內Ca2+濃度增加，DAG可激活PKC，活化的PKC可以與Ca2+各自激活CaMKⅡ促使CaMKⅡ通過自身磷酸化發(fā)揮生物學效應[11]。同時，濃度升高的Ca2+又可激活CaM，促進Ca2+與CaM形成Ca2+/CaM復合物，從而激活下游鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)。而CaN受CaM和Ca2+雙重調節(jié)，活化的CaN可以使細胞內活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)去磷酸化從而被活化，活化的NFAT遷移到細胞核內并在核內聚集繼而作用于下游靶分子。 簡言之，Wnt/Ca2+通路以胞內Ca2+濃度升高為基點，激活PKC、CaMKⅡ、NFAT以及其他信號傳導因子、轉錄因子，發(fā)揮調節(jié)細胞黏連和基因表達等作用。

2 Wnt/Ca2+信號通路中Ca2+、CaM及CaMKⅡ在LIRI中的作用

Ca2+是細胞內最重要的第二信使，主要由CaM控制。目前已發(fā)現的肌漿網上與鈣釋放、攝取、貯存有關的CaM主要有以下幾種：三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor，IP3R)、肌漿網鈣泵(sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)、蘭尼啶受體(ryanodine receptor，RyR)等。IP3R、SERCA和RyR都存在3種不同的亞型，每種亞型在不同肌肉組織中表達有所不同。骨骼肌細胞肌漿網中存在IP3敏感和IP3不敏感兩種鈣池，胞內處于游離狀態(tài)的Ca2+便儲存其中，由IP3R和RyR兩種系統(tǒng)分別控制，兩者通過不同的Ca2+離子通道將鈣池中的Ca2+釋放到細胞質中，引起肌肉收縮。其中在骨骼肌中主要是Cav1.1型鈣離子通道[12-13]。而SERCA的作用卻恰恰相反，是將細胞質中的Ca2+轉運回肌漿網中。機體缺血/再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)是細胞內鈣超載，已經得到大多數研究者的共識。最新研究發(fā)現，CaMKⅡ等與鈣調節(jié)蛋白相關的酶是維持細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的重要因素[14]，其中IP3R和內質網鈣池中Ca2+轉運在細胞內信號傳導系統(tǒng)中扮演著重要角色，但當Ca2+代謝轉運失調，過度激活或是過度釋放Ca2+時又可誘發(fā)細胞凋亡。研究發(fā)現[15]，當機體處于缺血缺氧狀態(tài)，內質網和線粒體等處鈣離子通道則被激活，大量的Ca2+發(fā)生內流效應，被釋放進入細胞質，繼而導致Ca2+超載。細胞內Ca2+平衡狀態(tài)被打破，一系列Ca2+依賴性酶促反應由于大量內流的Ca2+而被激活，從而導致細胞的凋亡。也有實驗報道[16]，機體持續(xù)損傷激活CaMKⅡ信號通路，CaMKⅡ被氧化激活，促炎基因如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、補體因子B (complement factor B，CFB)的含量明顯增多，產生炎癥反應，而降低CaMKⅡ的活性，抑制鈣超載發(fā)生機制，對重要組織器官具有保護作用。

3 Wnt/Ca2+信號通路與LIRI病理機制研究

3.1Wnt/Ca2+信號通路介導細胞內Ca2+超載機制研究當Wnt信號與胞膜上Fz受體結合后，激活胞內的G蛋白和DVL，通過活化的G蛋白和DVL激活下游的PLC，活化的PLC又可以將PIP2水解，生成第二信使IP3和DAG。IP3可擴散至內質網或肌漿網，并與內質網或肌漿網上的IP3R、RyR結合，使后者激活，導致內質網或肌漿網中Ca2+釋放。此外，IP3本身作為Ca2+通道激活劑，又可使細胞膜上鈣離子通道開放引起Ca2+內流。與此同時，DAG被固定于細胞膜上，激活PKC，活化的PKC一方面能增強Na+-H+的交換，迅速激活Na+-Ca2+交換蛋白增加Na+-Ca2+的交換，Na+向胞外轉移的同時，Ca2+進入胞質內，使胞質Ca2+濃度上升；另一方面，又可抑制SERCA基因表達，加劇胞質內Ca2+累積。濃度上升的Ca2+，反過來又可作用于PKC使其活化。CaM是胞內Ca2+受體，可與之發(fā)生可逆性結合，當Ca2+濃度升高后，可促進與CaM相結合，使CaM構象發(fā)生變化，形成Ca2+/CaM復合物。Ca2+/CaM復合物則是一種參與多種信號轉導途徑的信號分子，為細胞信號傳遞的重要物質，既可以作用于CaMKⅡ[17]，促使CaMKⅡ與鈣化的鈣調蛋白(Ca2+/CaM)結合，從而導致CaMKⅡ抑制性結構域移位，發(fā)生自動磷酸化而被活化。即使當Ca2+濃度下降后，磷酸化的鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(phospho-CaMKⅡ,p-CaMKⅡ) 活性仍能保持其狀態(tài)。Ca2+/CaM復合物又能使受磷蛋白(phospholamban，PLB)磷酸化而活化，抑制SERCA的活性，從而導致Ca2+從肌漿網中向胞質內反向轉移，加劇胞質內Ca2+累積。高濃度Ca2+降解細胞內的磷脂酶、溶酶體、蛋白酶、核酸酶等酶，對細胞的完整性造成不可逆轉的損害，繼而導致細胞凋亡，導致炎癥損害和細胞死亡[18]。除此之外，由于Wnt/Ca2+通路介導所致Ca2+濃度升高，致使線粒體氧化磷酸化功能受損，ATP合成障礙，ATP依賴性Na+，K+-ATPases和Ca2+-ATPases被抑制，只能通過逆轉Na+-Ca2+的作用機制來恢復胞質內Na+的濃度，造成惡性循環(huán)，直至誘發(fā)鈣超載現象。研究證實，由此引發(fā)的鈣超載在缺血/再灌注損傷中起著重要作用，且在再灌注期更為明顯[18]。

3.2Wnt/Ca2+信號通路介導炎癥反應機制研究炎癥反應是LIRI病情發(fā)展的關鍵步驟。在Wnt/Ca2+信號通路中，Wnt5a可通過調控炎癥因子的產生，參與炎癥應答，某些炎癥因子，如TNF-α也可以反過來誘導Wnt5a的表達，促進炎癥進一步發(fā)展。巨噬細胞自分泌Wnt5a作用于自身，通過活化Wnt5a/Fz5-CaMKⅡ信號途徑誘導分泌炎性因子IL-6、IL-8、巨噬細胞炎癥蛋白1β(macrophage inflammatory protein 1β，MIP-1β)等[19]。此外，Wnt5a還能夠誘導環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)等其他炎癥因子的表達，當敲除或阻斷Wnt5a能夠降低COX-2的產生[20]。Wnt5a與結構類似 G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)的受體結合，激活G蛋白，活化的G蛋白再激活下游各種效應器，使胞內Ca2+濃度上升，Ca2+繼而激活PKC和CaMKⅡ。PKC激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)，活化的MAPK最終使細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)或MEK(MAPK與ERK結合復合物)磷酸化，從而誘導調控TNF-α、IL[swy4]-1、IL-6、IL-8、MIP-1β、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)等炎癥因子；活化的CaMKII又可激活轉化生長因子激酶1(transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1)，從而使IκB激酶( IκB kinase，IKK)活化，繼而使IκB磷酸化并泛素化降解，釋放核轉錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)入核，啟動炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1的轉錄。NF-κB作為一種快速反應因子，在LIRI的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。在骨骼肌缺血/再灌注損傷實驗模型中，NF-κB表達升高，而抑制其表達能減輕炎癥反應，并提高生存率，因此，適度干預NF-κB的活化有一定的臨床應用價值[21]。TNF-α既能促進NF-κB表達，又依賴NF-κB反作用于下游內源性Wnt5a，促進細胞分泌Wnt5a。Wnt5a/Ca2+通路與炎癥信號途徑組成了繁雜的網絡系統(tǒng)，二者聯系密切又交互影響，Wnt5a/Ca2+通路的失衡會導致炎癥應答的紊亂，從而誘發(fā)一系列炎性損害。

3.3Wnt/Ca2+信號通路介導細胞凋亡機制研究細胞凋亡機制參與LIRI損傷早有報道[22]，一般認為細胞凋亡是缺血/再灌注損傷誘發(fā)骨骼肌細胞死亡必然發(fā)生的過程。在LIRI損傷過程中，大量骨骼肌出現凋亡現象,而Wnt/Ca2+通路介導細胞凋亡的作用機制主要基于胞內氧自由基合成和Ca2+代謝異常。Hatoko等[23]發(fā)現，肢體在缺血6 h后，恢復血流灌注可引起腓腸肌的Bax蛋白表達升高，出現凋亡細胞。Wnt/Ca2+通路通過一系列傳導激活Ca2+依賴性PKC，將PIP2水解，并激活CaMKⅡ，促使細胞內的許多生物酶降解，繼而破壞細胞膜及細胞骨架，促使細胞內大量黃嘌磷脫氫酶轉化為黃嘌呤氧化酶，繼而合成大量氧自由基。合成的氧自由基則繼續(xù)破壞細胞膜，并引起溶酶體、線粒體等細胞器膜的破裂，進而影響細胞信號傳導系統(tǒng)，激發(fā)Bax等調控基因，導致凋亡[24]。此外，Wnt/Ca2+信號通路所引發(fā)的鈣超載現象一方面可導致細胞膜中ATP依賴性離子交換通道功能異常，導致Ca2+轉出障礙，又可引起線粒體內的膜通透性轉換孔開放，釋放細胞色素C進入細胞質，并進一步激活天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶降解底物，導致凋亡。與此同時，Calpain等鈣蛋白酶被激活，破壞細胞膜的結構，并在分解PIP2的過程中產生溶血磷脂，溶血磷脂進入線粒體內，導致ATP合成障礙。線粒體雖然可通過膜電位依賴性鈣單向轉運體攝取Ca2+，但大量Ca2+則以碳酸鹽的形式沉積線粒體中，抑制其氧化磷酸化功能，加速細胞凋亡。Quindry等[25]報道，線粒體內ATP合成障礙時，Ca2+堆積升高，可誘導細胞凋亡。

4 結語及展望

綜上所述，引起LIRI的機制多樣且環(huán)節(jié)復雜，但Ca2+超載、炎癥反應以及細胞凋亡是促使LIRI發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，而Wnt/Ca2+信號通路恰與之關系密切，在LIRI多個環(huán)節(jié)中扮演著重要角色。然而，當前Wnt/Ca2+信號通路在LIRI機制方面的研究尚不如心、腦、肝、腎等器官那樣深入，仍需要廣大醫(yī)務工作者進行更深入的研究，進一步明確Wnt/Ca2+信號通路的組成成分及其作用機制。隨著分子生物及基因工程技術的發(fā)展，相信基于Wnt/Ca2+信號通路的LIRI機制將會被進一步闡明，從而探究Wnt/Ca2+信號通路在LIRI中的作用環(huán)節(jié)，明確藥物作用靶點，為防治LIRI提供新的有效的治療方法。