麝香保心丸通過調(diào)節(jié)apelin/APJ信號轉(zhuǎn)導通路減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心功能異常的實驗研究

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急性心肌梗死(AMI)是臨床工作中的常見病、危重病，嚴重影響人們的身體健康。雖然近年來藥物及冠脈介入治療的進展明顯提高了AMI的生存率，但是AMI發(fā)病后由于心肌損傷導致的心力衰竭仍嚴重影響病人的預后及生活質(zhì)量。因此研究保護心肌損傷后心功能的藥物及探索相關機制仍是一項重要的研究課題。麝香保心丸是心內(nèi)科臨床常用的中成藥，其在心血管疾病中的療效逐漸被廣大醫(yī)生及病人所認可。麝香保心丸主要由人工麝香、蘇合香、人工牛黃、人參提取物、肉桂、蟾酥、冰片等多種名貴中藥材組成[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸具有擴張冠狀動脈，減慢心室率，改善冠狀動脈血流量，降低心肌耗氧量[2]，促進心肌缺血部位血管再生[3-4]，減輕心肌纖維化[5]，減少氯吡格雷抵抗[6]等作用。另有學者報道麝香保心丸具有益氣強心，芳香溫通等功效，可明顯改善心功能不全[7]，但是具體相關機制目前仍不明確，因此，本研究旨在觀察麝香保心丸對大鼠急性心肌損傷后心功能不全的影響，并探討相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及實驗動物 麝香保心丸，上海和黃藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號100312，規(guī)格 22.5 mg，每只大鼠用量為 50 mg/(kg·d)，為預實驗中效果最佳劑量。健康SPF級雄性Wistar大鼠由中國醫(yī)科大學大學動物實驗中心提供，apelin ELISA 試劑盒購自中美科技公司；BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒及化學發(fā)光檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司；硝酸纖維素膜購自美國 Bio-Rad 公司；所有一抗及二抗均購于Abcam公司。

1.2 主要儀器 HX-100E小動物呼吸機(蕪湖市一帆醫(yī)療器械商行)；BL-420S 生物機能實驗系統(tǒng)(合肥遠明科技有限公司)；BESN-Ⅱ多通道動物無創(chuàng)測壓儀(南京德賽生物公司)；Model 680 型酶標儀(美國 BIO-RAD 公司)；TGL16M 高速冷凍離心機(合肥遠明科技有限公司)；UV-3200PCS 紫外-可見分光光度計(合肥市科隆商貿(mào)有限責任公司)；FA 25 勻漿機(合肥遠明科技有限公司)；Medlab 生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)；全自動生化分析儀(日本OLYMPUS AU5400)； Bio-Pro 200E 凝膠成像系統(tǒng)(合肥遠明科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及給藥 健康SPF級雄性Wistar大鼠36只，體重320 g～340 g，采用隨機數(shù)字法分為3組，每組12只。正常對照組(Control組)：灌胃生理鹽水30 d；模型組(I/R組)灌胃生理鹽水30 d后制備心肌缺血/再灌注模型；麝香保心丸組 (SXBXW組)：將麝香保心丸溶于生理鹽水中，連續(xù)灌30 d，后制備心肌缺血/再灌注模型。

1.3.2 動物模型制備 將大鼠用20%烏拉坦(0.5 mL/100 g) 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于恒溫動物解剖臺上，連續(xù)監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖以檢測心臟情況。按照文獻進行實驗手術操作[8]。頸正中切口行氣管插管，連接動物呼吸機(呼吸頻率70次/min～80次/min，潮氣量 40 mL/min，吸呼比維持在1∶3)進行人工呼吸。胸部正中切口，撐開左側(cè)第4 肋間，剪開心包，暴露心臟，于左冠狀動脈前降支起始部下2 mm處穿一縫合線，以Ⅱ?qū)?lián)心電圖J點弓背抬高，T波異常為成功結(jié)扎。關閉胸腔，30 min后重新打開胸腔，用剪刀將結(jié)扎線剪開，關閉胸腔，縫合皮膚(24 h后取組織標本)。

1.3.3 尾動脈血壓監(jiān)測 于最后一次用藥24 h后用標準尾部測壓法測量尾動脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)。每只大鼠間隔1 min測量5次，取5次測量的平均值作為大鼠尾動脈收縮壓、舒張壓，并計算出平均動脈壓(MBP)。

1.3.4 血流動力學檢測 測量血壓完畢后充分麻醉分離出右頸總動脈，將PE50聚乙烯動脈導管經(jīng)右頸總動脈插入至左心室，固定后用生理記錄儀記錄左室收縮壓(LVSP)、 左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dtmax)及下降最大速率(-dp/dtmax)。

1.3.5 樣本采集 血流動力學檢測完畢后，頸動脈取血A、B兩管，每管2 mL～3 mL，其中A管含1% 肝素鈉溶液0.1 mL，離心(1 000 r/min，10 min)，分離血漿；B管待血液凝固后，離心(2 000 r/min，20 min)，分離血清。分別將收集的血漿和血清于-20 ℃ 凍存。取血后立即處死大鼠取出心臟，沿冠狀溝走行分離左心室心肌，每組取4個標本置于10%中性甲醛中固定 24 h，石蠟包埋有待行HE染色，其余部分立即保存于-80 ℃液氮中用于進一步測定。另取心室組織 1份與PBS混合，制備10%組織勻漿，離心，取上清液于-20 ℃ 凍存。

1.3.6 生化指標檢測 用自動生化分析儀檢測血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脫氫酶(LDH)的含量。

1.3.7 HE染色 將固定好的心肌組織常規(guī)石蠟包埋，Leica石蠟切片機連續(xù)切片，厚度約5 μm，HE程序染色，Olympus顯微鏡觀察病理改變。

1.3.8 血漿及心肌apelin含量測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血漿和心肌組織apelin 含量。

1.3.9 Western blot法測定apelin和APJ蛋白的表達水平 取出凍存組織，在裂解緩沖液中裂解，冰浴下勻漿，4 ℃離心(10 000 r/min，10 min )，取上清液，測定蛋白濃度后，制成蛋白濃度相等的樣品，取40 μL蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，3%BSA 封閉 2 h，分別滴加兔抗鼠apelin (ab125213，dilution，1∶500；Abcam，Cambridge，United Kingdom)，APJ (ab214369，dilution，1∶500；Abcam，Cambridge，United Kingdom)抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜后以相應堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h，堿性磷酸酶顯色，于凝膠自動成像分析系統(tǒng)下成像。

2 結(jié) 果

2.1 各組體重、心臟重量、心臟指數(shù)的比較 各組間體重、心臟重量、心臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠體重、心重及心臟指數(shù)的比較(±s)

2.2 各組大鼠血壓、平均動脈壓及心率的比較 I/R組大鼠SBP、DBP、MBP較Control組明顯降低(P<0.01)，但SXBXW組大鼠SBP、DBP、MBP較Control組明顯升高(P<0.05或P<0.01)。各組間HR變化不明顯。詳見表2。

表2 各組大鼠血壓、平均動脈壓及心率比較(±s)

2.3 各組大鼠血流動力學變化 I/R組大鼠±dp/dtmax及LVSP較Control組明顯下降(P<0.01)，但LVEDP較Control組明顯升高(P<0.01)；與I/R組比較，SXBXW組±dp/dtmaxLVSP明顯升高，LVEDP顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

表3 各組大鼠血流動力學變化(±s)

2.4 各組大鼠心肌病理學改變 Control組：心肌細胞形態(tài)正常，細胞核居細胞中央，心肌間質(zhì)未見明顯變性、壞死及炎細胞浸潤。I/R組：有明顯的心肌缺血壞死及炎癥細胞浸潤，細胞核變形及排列紊亂，心肌間質(zhì)增寬并部分出現(xiàn)炎細胞浸潤。麝香保心丸組：與模型組比較，麝香保心丸組心肌細胞壞死及炎癥細胞浸潤減輕，壞死灶面積減小，細胞核變形及排列紊亂現(xiàn)象減輕。詳見圖1。

圖1各組心肌病理改變(HE染色×400)

2.5 各組大鼠血清心肌酶的變化 I/R組CK-MB及LDH明顯高于Control 組(P<0.01)。麝香保心丸預處理后，血清LDH及CK-MB下降(P<0.01)，提示麝香保心丸對心肌缺血/再灌注損傷有保護作用。詳見圖2。

注：與Control組比較，##P<0.01；與I/R組比較，**P<0.01。
圖2各組大鼠LDH及CK-MB的變化

2.6 各組大鼠血漿及心肌apelin含量的變化 I/R組血漿及心肌apelin含量低于Control 組(P<0.01)，與I/R組比較，麝香保心丸預處理可使血漿及心肌apelin含量升高(P<0.05或P<0.01)。詳見圖3。

注：與Control組比較，##P<0.01；與I/R組比較，*P<0.05，**P<0.01。
圖3各組大鼠血漿及心肌apelin變化

2.7 各組大鼠心肌apelin及APJ蛋白含量的變化 I/R組心肌apelin及APJ蛋白表達低于Control 組(P<0.01)。SXBXW組血漿及心肌apelin含量較I/R組明顯升高(P<0.01)。詳見圖4。

注：與Control組比較，##P<0.01；與I/R組比較，**P<0.01。
圖4各組大鼠心肌apelin及APJ蛋白含量的比較

3 討 論

由宋代經(jīng)典名方《太平惠民和劑局方》中的蘇合香丸衍生而來的麝香保心丸是臨床中常用的中成藥，自古以來被廣泛應用于冠心病、心功能不全等心血管疾病的治療。大量基礎藥理學研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸具有多重藥理學作用，例如擴張冠狀動脈，改善心肌重構，減慢心室率，降低心肌耗氧量，改善冠脈血管痙攣，保護血管內(nèi)皮細胞，減輕心肌纖維化，改善缺血心肌局部微循環(huán)，促進缺血心肌血管再生?，F(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)麝香保心丸具有改善心功能的作用，但是相關機制研究仍不明了，因此進一步研究麝香保心丸的強心機制仍是一項重要的工作。

在本項研究中，通過檢測大鼠無創(chuàng)血壓、血流動力學、心肌病理學改變、心肌酶的變化，發(fā)現(xiàn)麝香保心丸具有保護大鼠缺血/再灌注心肌損傷，改善心功能的作用。

為了進一步研究麝香保心丸的相關保護機制，又對apelin/APJ信號轉(zhuǎn)導通路進行了研究。apelin 是一種最早從牛胃中分離出來的具有重要作用的原前體肽，它廣泛存在于各種組織當中并在心肌及冠狀動脈中高度表達，具有明顯的擴張血管、降低血壓、正性肌力等多種生物學功能。有研究表明apelin是 APJ 的天然配體，二者組成的apelin/APJ系統(tǒng)在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用[9-10]。有學者發(fā)現(xiàn)，在擴張型心肌病及缺血性心臟病病人中，應用apelin后心功能改善不佳，其機制主要由于心室APJ 的表達明顯減少，導致apelin的正性肌力作用可能受到限制[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)當出現(xiàn)心肌損傷時，因血漿和心肌的 apelin水平下降，通過外源性干預 apelin的生成可減緩心力衰竭的發(fā)展[12]。據(jù)報道apelin表達缺陷的小鼠有明顯進展為心衰的趨勢，應用apelin干預后可逆轉(zhuǎn)這一過程[8]。因此apelin/APJ信號轉(zhuǎn)導通路是改善機體心功能不全的一個重要作用靶點。本研究通過檢測血漿及心肌apelin的含量發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸可以明顯提高大鼠血漿及心肌中apelin的含量。同時Western-blot也發(fā)現(xiàn)心肌apelin及APJ的蛋白表達在麝香保心丸預處理組可明顯升高，提示麝香保心丸是部分通過調(diào)節(jié)apeli/APJ信號轉(zhuǎn)導通路來實現(xiàn)改善心功能不全。

本實驗表明麝香保心丸可以減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷，明顯提高心功能，這種保護作用可能是部分通過激活apelin/APJ信號轉(zhuǎn)導通路來實現(xiàn)的。此結(jié)果將為闡明麝香保心丸的心肌保護作用及臨床應用提供更多實驗依據(jù)及理論依據(jù)。

綜上所述，麝香保心丸具有保護大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心功能異常，這種保護作用部分通過調(diào)節(jié)apeli/APJ信號轉(zhuǎn)導通路來實現(xiàn)。

[1] Yan SK，Zhang WD，Liu RH，et al.Chemical fingerprinting of Shexiang Baoxin Pill and simultaneous determination of its major constituents by HPLC with evaporative light scattering detection and electrospray mass spectrometric detection [J].Chem Pharm Bull (Tokyo)， 2006，54(7)：1058-1062.

[2] Zhang XZ，Hou YM，Ou ZH.Effect of Shexiang Baoxin pill on coronary vasodilation by analysis of coronary angiography [J].Chin J Integr Trad West Med， 2014，34(12)：1432-1435.

[3] Huang F，Liu Y，Yang X，et al.Shexiang Baoxin pills promotes angiogenesis in myocardial infarction rats via up-regulation of 20-HETE-mediated endothelial progenitor cells mobilization [J].Atherosclerosis， 2017，263：184-191.

[4] Shen W，F(xiàn)an WH，Shi HM.Effects of Shexiang Baoxin pill on angiogenesis in atherosclerosis plaque and ischemic myocardium[J].Chin J Integr Trad West Med，2010，30(12)：1284-1287.

[5] Wu DJ，Hong HS，Jiang Q.Effect of Shexiang Baoxin pill in alleviating myocardial fibrosis in spontaneous hypertensive rats[J].Chin J Integr Trad West Med， 2005，25(4)：350-353.

[6] Zhang L，Liu N，Zhang J，et al.Effect of Shexiang Baoxin pills on clopidogrel resistance in patients with acute coronary syndrome [J].Pak J Pharm Sci， 2016，29(6 Suppl)：2303-2306.

[7] Li YF，Cao FF，Liu F，et al.Effects of Shexiangbaoxin pills on the expression of cardiac α- and β-adrenergic receptor subtypes in rat hearts with heart failure induced by myocardial infarction [J].Chin Med J(Engl)， 2012，125(9)：1556-1562.

[8] Kuba K，Zhang L，Imai Y，et al.Impaired heart contractility in Apelin gene-deficient mice associated with aging and pressure overload[J].Circ Res，2007，101： e32-e42.

[9] Kleinz MJ，Davenport AP.Immunocytochemical localization of the endogenous vasoactive peptide apelin to human vascular and endocardial endothelial cells [J].Regul Pept，2004，11(8)：119-125.

[10] Yu XH，Tang ZB，Liu LJ，et al.Apelin and its receptor APJ in cardiovascular diseases [J].Clin Chim Acta，2014，428：1-8.

[11] Pitkin SL，Maguire JJ，Kuc RE.Modulation of the Apelin/APJ system in herat failure and atherosclerosis in man [J].Br J Pharmacol，2010，160(7)：1785-1795.

[12] Koguchi W，Kobayashi N，Takeshima H.Cardioprotective effect of Apelin- 13 on cardiac performance and remodeling in end-stage heart failure [J].Circ J，2012，76(1)：137-144.