莧菜芽生長中相關(guān)酶及抗氧化活性的變化

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(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江寧波 315211)

莧菜(AmaranthustricolorL.)為莧科莧屬、一年生草本植物,在氨基酸、脂肪酸及微量元素等組成和含量方面是一種難得的優(yōu)質(zhì)功能食品資源[1]。由于莧菜中不含草酸,所含鈣、鐵等礦物質(zhì)進入人體后很容易被吸收利用[2]。因此,莧菜能促進小兒的生長發(fā)育,對骨折的愈合具有一定的食療價值[3]。另外,花紅莧和紅葉莧的根、莖、葉中富含一種由酮類和醌類衍生的次級代謝產(chǎn)物——莧紅素,它不同于花青素,屬于甜菜素類中甜菜紅素亞型的生物色素[4]。是一種易溶于水的含氮有機物,具有高抗癌、抗氧化的特性,并且具有降血脂,保護眼睛等藥用價值[5]。莧紅素作為一種天然色素逐漸受到人們的重視。

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)最早發(fā)現(xiàn)于茉莉?qū)偎剀盎ㄖ?是茉莉花的主要芳香物質(zhì),它是調(diào)控植物次生代謝物合成的重要激素,可以作為信號分子激發(fā)植物的化學(xué)防御[6]。有研究表明茉莉酸甲酯能夠促進莧菜中莧紅素的積累,并能影響莧紅素合成關(guān)鍵酶——酪氨酸酶的活性[7]。MeJA也能促進苦玄參苷的積累,提高藥材品質(zhì)[8]。采用茉莉酸甲酯浸種,通過影響水稻幼苗葉片中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)的活性來減輕水稻幼苗白葉枯病的發(fā)生[9]。本實驗采用MeJA溶液培養(yǎng)莧菜種子,并對常用的評價植物化感作用的生物指標(biāo),包括種子萌發(fā)的各項指標(biāo)(發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù))、植物生長指標(biāo)(根長、全長)、植株生理生化指標(biāo)(抗氧化物保護酶活性)進行檢測[10],為莧菜芽生長過程中抗氧化酶活性的變化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

莧菜種子(當(dāng)年產(chǎn)收) 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝店;乙醇、次氯酸鈉 分析純,購自寧波百川生物科技有限公司;十二水和磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、福林酚、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP) 均為分析純；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試盒、H2O2測試盒 南京建成生物工程研究所。

RXZ-500D-LED型人工氣候箱 寧波江南儀器廠;DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;754型紫外分光光度計 上海菁華科技有限公司;TGL-16型高速冷凍離心機 湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茉莉酸甲酯溶液的配制 用pH6.8的磷酸鹽緩沖液作為溶劑,加入茉莉酸甲酯配成質(zhì)量濃度為0.01 mol/L的茉莉酸甲酯母液(用超聲波清洗機輔助溶解),用溶劑將母液稀釋成10、20、50、80、100、150 μmol/L的處理液,實驗前配制,緩沖液作對照處理。

1.2.2 莧菜種子的前處理和露白實驗 參照農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程,挑選當(dāng)年產(chǎn)收、無霉變和破損,顆粒飽滿的莧菜種子,置于5～10 ℃的環(huán)境中破除種子休眠后取出,用超純水清洗兩遍,除去雜質(zhì)和灰塵,在75%的乙醇水溶液中浸泡30 s,再放入0.3%的NaClO溶液中浸泡30 min后置于無菌的濾紙上瀝干。將消毒后的種子均勻播于鋪有2層濾紙的發(fā)芽盒中,濾紙經(jīng)清水浸濕,其上覆蓋一層濕潤的濾紙,整體置于溫度為26 ℃,濕度為85%的培養(yǎng)箱中,在黑暗條件下培養(yǎng),直至莧菜種子露白。

1.2.3 莧菜種子最優(yōu)培養(yǎng)液濃度的篩選 將露白的莧菜種子播于新的鋪有濾紙的培養(yǎng)盒中,加入不同濃度(10、20、50、80、100和150 μmol/L)的MeJA溶液作為培養(yǎng)液,空白對照加入pH6.8的磷酸鹽緩沖液。培養(yǎng)條件為:26 ℃下,12 h光周期,12 h暗周期,光照強度為6000 LX,種子放入以后用保鮮膜蓋好,不同處理每隔48 h添加3 mL相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液。8 d后采收,根據(jù)莧菜芽的生長情況及莧紅素的含量確定最優(yōu)培養(yǎng)液濃度。實驗重復(fù)5次以上。

1.2.4 茉莉酸甲酯溶液對莧菜種子萌發(fā)的影響 采用1.2.2中的方法將種子消毒,并用相同的方法使種子露白。將每50粒露白的種子放入有兩層濾紙的培養(yǎng)瓶中,用最優(yōu)濃度的MeJA溶液和pH6.8磷酸鹽緩沖液作為培養(yǎng)液,在與1.2.3相同的條件下進行培養(yǎng)。實驗重復(fù)3次。記錄種子每天的萌發(fā)數(shù)量(以胚根突破種皮為準(zhǔn)),統(tǒng)計種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、種子活力指數(shù)。種子萌發(fā)過程中每隔2 d取樣,用游標(biāo)卡尺測定莧菜的根長和全長。每次隨機取樣,挑出30根(每組重復(fù)各10根)莧菜芽進行測定。

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100

發(fā)芽勢(%)=規(guī)定日期內(nèi)(3 d)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100

式中:Dt-發(fā)芽實驗第幾日;Gt-第幾日的發(fā)芽數(shù)。

1.3.1 面積 種公羊面積需求為每只4m2以上，妊娠母羊面積需求為每只1m2以上，空懷母羊面積需求為每只0.8m2以上，育成羊面積需求為每只0.6m2以上。

活力指數(shù)(VI)=S×Gi

式中：Gi-發(fā)芽指數(shù);S-種苗生長量。

1.2.5 莧菜芽的培育 采用1.2.2和1.2.3中的方法培育莧菜芽,每隔2 d取樣,液氮冷凍后放入-20 ℃冰箱內(nèi)保存,用于生理生化指標(biāo)測定。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 莧紅素含量測定 參照Sanjay等[11]的方法稍加改動。稱取莧菜樣品0.5 g于研缽中,加少量石英砂及5 mL、pH6.5的檸檬酸-磷酸緩沖液研磨后,于4 ℃冰箱中靜置30 min。在10000 r/min的條件下冷凍離心15 min后取上清液,用提取液稀釋5倍后,在538 nm波長處測定吸光度。按以下公式計算莧紅素含量:

式中,A為538 nm處的吸光度值;Df為樣品稀釋倍數(shù);Mw為甜菜紅素的相對分子質(zhì)量(550 g/mol);Vd為勻漿液體積(mL);ε為甜菜紅素摩爾消光系數(shù)(60000 L/mol·cm);L為光程(cm);Wd為樣品質(zhì)量(g)。

表1 不同濃度MeJA溶液對莧菜種子發(fā)芽指標(biāo)的影響Table 1 Effect of various MeJA concentrations on the seed germination index of amaranth

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。表2同。1.3.2 總酚含量的測定 在王行等[12]方法的基礎(chǔ)上有所改進。稱取0.5 g樣品,用5 mL 70%(v∶v)乙醇研磨,在10000 r/min,4 ℃的條件下離心10 min后取上清液稀釋10倍,取0.5 mL稀釋液與反應(yīng)液(包含0.25 mL福林酚試劑,1.375 mL水,0.75 mL 10% Na2CO3)混合均勻,20 ℃水浴1 h,在765 nm波長下測定吸光值。實驗重復(fù)3次。相同方法下采用沒食子酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0143x+0.0289)。

1.3.3 H2O2含量測定 稱取0.5 g樣品加5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0,含3% PVP),冰浴研磨,4 ℃ 12000 r/min離心20 min,取上清液。之后根據(jù)H2O2測試盒的說明進行測定。

表2 MeJA處理對莧菜芽根長和全長的影響Table 2 Effect of MeJA treatment on the root length and overall length of amaranth bud

1.3.4 抗氧化酶活性測定 POD和CAT活性測定參照Toivonen等[13]的方法稍加改動。POD采用愈創(chuàng)木酚法進行測定,以每分鐘內(nèi)A470光吸收值變化0.01為一個酶活力單位。CAT以反應(yīng)液在每分鐘內(nèi)A240光吸收值減少0.1為一個酶活力單位。APX活性的測定參照成少寧等[14]的方法有所改動。APX以反應(yīng)液每分鐘內(nèi)A290光吸收值變化0.1為一個酶活力單位。樣品制備同H2O2,之后按照超氧化物歧化酶(SOD)測試盒測定SOD活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗中各指標(biāo)均重復(fù)測定3次,取其平均值。數(shù)據(jù)圖片用Origin Pro 8.0繪制,并采用SAS 9.0軟件方差分析中的Duncan’s Multiple Range Test(p<0.05)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度MeJA處理對莧菜種子發(fā)芽情況的影響

發(fā)芽率能近似地反應(yīng)出苗率,而發(fā)芽勢的大小表明發(fā)芽速率的快慢,發(fā)芽指數(shù)是發(fā)芽率指標(biāo)的細(xì)化和深化,它放大了種子活力的特征,使好壞種子的差異加大,活力指數(shù)是種子發(fā)芽速率和生長量的綜合反映。

由表1可知,不同濃度的MeJA處理對莧菜芽的生長均有不同程度的影響。與空白對照組相比,MeJA抑制了莧菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。50 μmol/L MeJA處理抑制作用較明顯,其他濃度抑制作用相差不大。

2.2 不同濃度MeJA處理對莧紅素含量的影響

茉莉酸甲酯是調(diào)控植物次生代謝物合成的重要激素,可以調(diào)控多種植物次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。由圖1可知,MeJA處理顯著(p<0.05)提高了莧菜中莧紅素的含量。與空白對照相比,在濃度為10～150 μmol/L的范圍中,100 μmol/L MeJA處理組效果最好,其莧紅素含量約為空白對照的2.38倍。戰(zhàn)晴晴等[15]研究表明,MeJA處理對北柴胡不定根中柴胡皂苷含量的積累有明顯的促進作用,并且當(dāng)MeJA濃度為200 μmol/L時,柴胡皂苷含量最高;與Cao等[16]的研究結(jié)果一致,當(dāng)茉莉酸甲酯的濃度為100 μmol/L時,莧菜中莧紅素的含量達(dá)到最高。低于此濃度時,隨著濃度的升高,莧紅素得到進一步的積累,而高于此濃度時,莧紅素的合成則受到抑制,這與賓金華等[17]關(guān)于MeJA對水稻和花生種子的萌發(fā)表現(xiàn)出“雙重性”效應(yīng)的研究結(jié)果相似。

圖1 不同濃度MeJA處理對莧紅素含量的影響Fig.1 Effect of various MeJA concentrations on content of amaranthin注：標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

綜合莧菜種子的發(fā)芽情況和莧紅素含量,選取100 μmol/L MeJA處理用于后面的生理生化實驗。

2.3 MeJA溶液對莧菜芽生長過程中根長和全長的影響

表2反映了種子萌發(fā)過程中莧菜芽根長和全長的變化。隨著培養(yǎng)時間的延長,莧菜芽的根長和全長逐漸增長,在第2～4 d時生長速度較快,隨后幾天速度減緩。相比于空白對照,經(jīng)100 μmol/L MeJA處理過的莧菜芽的根長和全長受到了顯著(p<0.05)的抑制,并且在培養(yǎng)過程中,MeJA處理組的莧菜芽葉片展開的時間也較空白對照晚。因此,MeJA處理對莧菜種子生長無積極影響。

雖然MeJA的使用能夠富集莧菜中的莧紅素,但經(jīng)過處理的莧菜芽,其根長和全長受到了顯著地抑制,這是由于MeJA可以促進乙烯生成,抑制植物生長,減少植物生物量的生成[18-19]。用茉莉酸甲酯噴施苦玄參幼苗,雖然提高了苦玄參苷的積累量,但同時會抑制其株高、葉片以及分枝的生長,將其成熟期提前,縮短了其生育期。這與謝陽嬌等[8]研究結(jié)果相似。

2.4 MeJA處理對莧菜芽生長過程中莧紅素含量的影響

由圖2可見,莧紅素的含量隨培養(yǎng)時間的延長呈上升趨勢,而在整個生長周期內(nèi),MeJA處理組中莧紅素的含量極顯著(p<0.01)高于空白對照。且在相同的培養(yǎng)時間內(nèi),MeJA處理組中莧紅素的積累量約為空白對照組的3.25倍。結(jié)果表明,外源MeJA處理能夠顯著促進莧紅素的合成。

圖2 培養(yǎng)過程中莧紅素含量的變化Fig.2 Change of amaranthin content in the process of cultivation注:與空白組比較，“**”在 0.01水平(雙側(cè))上有顯著差異,“*”在0.05水平(雙側(cè))上有顯著差異；圖3～圖5同。

2.5 MeJA處理對莧菜芽中總酚含量的影響

圖3 培養(yǎng)過程中總酚含量的變化Fig.3 Changes of total phenolic content in the process of cultivation

酚類物質(zhì)具有抗氧化能力,能夠幫助幼苗適應(yīng)周圍變化的環(huán)境[20]。圖3反映出莧菜芽在生長過程中總酚含量的變化。在莧菜種子發(fā)芽初期(2～4 d),MeJA處理組總酚含量急劇下降,這與種子萌發(fā)后酚類物質(zhì)結(jié)合一些有機物如碳水化合物或蛋白質(zhì)有關(guān)[21],隨著培養(yǎng)時間的延長,其下降趨勢趨于平緩,而空白對照組在發(fā)芽初期總酚含量基本不變,4 d后急劇下降,但整個過程中,MeJA處理組中總酚含量始終顯著(p<0.01)高于對照組,表明MeJA能夠提高莧菜芽中總酚含量。

2.6 MeJA處理對莧菜芽中H2O2含量的影響

H2O2含量在莧菜芽的整個培養(yǎng)過程中均處于上升趨勢。在發(fā)芽初期,MeJA處理組與空白對照組中H2O2含量相差不大,但當(dāng)發(fā)芽進行到第8 d時,空白對照組中H2O2迅速積累,含量約為處理組的1.97倍。H2O2的積累不利于莧菜芽的生長,而MeJA的使用能夠降低H2O2的積累速度,減輕對植物的損傷,有效提高莧菜芽品質(zhì)。

圖4 培養(yǎng)過程中H2O2含量的變化Fig.4 Changes of H2O2 content in the process of cultivation

2.7 MeJA處理對莧菜芽中抗氧化酶活性的影響

圖5 培養(yǎng)過程中抗氧化酶活性的變化Fig.5 Changes of antioxidase activity in the process of cultivation注:A:POD;B:CAT;C:APX;D:SOD。

結(jié)合圖4、圖5B和圖5C看出,莧菜種子發(fā)芽初期,由于CAT與APX活性較高,SOD活性較低,莧菜芽中積累的H2O2較少,隨著培養(yǎng)時間的延長,空白對照與茉莉酸甲酯處理組中CAT、APX活性均呈下降趨勢,SOD活性也逐漸升高,芽中H2O2也開始積累。但茉莉酸甲酯的使用,延緩了CAT、APX活性的下降,因此可減緩H2O2的積累速度。這與Cao等[24]的研究結(jié)果一致。圖5A中POD的活性呈上升趨勢,茉莉酸甲酯的使用雖能提高POD的活性來清除多余的H2O2,但POD能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素而抑制了莧菜芽的生長,胡海英等[25]也發(fā)現(xiàn)MeJA對甘草胚根和子葉生長的抑制作用可能是通過提高POD的活性來實現(xiàn)的。

3 結(jié)論

芽苗菜在我國具有十分悠久的歷史,品種也十分豐富,比如豆芽、芥菜芽、蘿卜芽、香椿芽、苜蓿等,開發(fā)芽苗菜新品種能夠使芽苗菜具有更好的品質(zhì)、附加值和功能性作用,能夠帶動整個芽苗菜產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟利益,具有十分廣闊的應(yīng)用前景[26]。本文提供了一種富含莧紅素的莧菜芽的培育方法,并且研究也發(fā)現(xiàn)外源MeJA能夠提高總酚含量,通過調(diào)節(jié)酶活性抑制的H2O2積累,提高莧菜芽品質(zhì)。但芽苗菜在生產(chǎn)過程中需考慮溫度、水分、通風(fēng)、光照等各種環(huán)境因素,否則容易出現(xiàn)爛種、芽苗不整齊、過老等問題[27],另外芽苗菜組織幼嫩,運輸和儲存困難。因此莧菜芽的推廣和應(yīng)用還需進一步研究。

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