毛細管電泳－電化學發(fā)光法測定金釵石斛中石斛堿的含量

鄧光輝，羅珍連

（廣西民族大學 化學化工學院 廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室，南寧530006）

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl）為蘭科屬多年附生草本植物，其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，享有“仙草”之美譽，是名貴中藥材石斛的來源之一［1］。金釵石斛的主要有效成分有生物堿類化合物、酚類化合物、多糖等［2］，其中，生物堿類成分是最早從石斛屬植物中分離得到的物質［3］。石斛堿為金釵石斛的特征性成分，具有止痛、解熱、降低心率和血壓、減慢呼吸、解巴比妥毒等作用［4－5］，有較高的研究開發(fā)價值。2010年版《中國藥典》以石斛堿含量作為金釵石斛的質量控制指標［6］。

石斛堿的測定方法有氣相色譜法［7－8］和高效液相色譜法［9－10］。與高效液相色譜法相比，毛細管電泳－電化學發(fā)光法（CE－ECL）是一種高效快速、樣品消耗少、成本低的分離檢測技術［11－12］。CE－ECL已經(jīng)成功應用于生物堿研究［13－17］，但尚未見到 CEECL測定金釵石斛堿的報道。本工作對金釵石斛中具有藥理活性成分的石斛堿進行提取，采用CEECL測定其含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI－A型毛細管電泳電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)，配未涂層石英毛細管（50μm×55cm）、直徑500μm鉑工作電極、Ag／AgCl參比電極和鉑輔助電極；PHS－3E型酸度計；KQ－100DB型數(shù)控超聲波清洗器；1810－B型自動雙蒸餾器。

Ru（bpy）32＋溶液：5mmol·L－1，稱取適量三聯(lián)吡啶氯化釕六水合物，用水溶解配制成20mmol·L－1溶液，再用70mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 8.10）稀釋配制成5mmol·L－1。

標準儲備溶液：500mg·L－1，稱取石斛堿對照品5.0mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，使用時用pH 8.10PBS進行稀釋。

石斛堿標準品純度99%，三聯(lián)吡啶氯化釕六水合物、甲醇、乙醇為分析純，試驗用水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

稱取金釵石斛粉末1.000 0g置于100mL錐形瓶中，加入乙醇50mL，稱定質量，超聲提取30min，冷卻，再稱定質量，用無水乙醇補足失重，濾液經(jīng)0.45μm乙酸纖維膜過濾備用。

依次 用 0.1mol·L－1NaOH 溶 液、水、10mmol·L－1PBS（pH 5.13）運行緩沖溶液將石英毛細管沖洗10min，將工作電極依次用0.3，0.05μm Al2O3粉末拋光，用水沖洗，再用水超聲清洗干凈，吹干，將電極與毛細管安裝在檢測池上，用光學顯微鏡調節(jié)毛細管與工作電極之間的距離為（100±5）μm。

在檢測池中加入5mmol·L－1Ru（bpy溶液，測定時將毛細管進樣端插入10mmol·L－1PBS（pH 5.13）中，待發(fā)光信號穩(wěn)定后，采用電動進樣，進樣電壓為10kV，進樣時間為10s，光電倍增管高壓為800V，檢測電位為1.17V，施加分離電壓為15kV進行分離檢測。

所有溶液在進入毛細管前經(jīng)0.45μm乙酸纖維素膜過濾，每2h換一次檢測池溶液，以保證試驗的穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 石斛堿與三聯(lián)吡啶釕發(fā)光體系的電化學發(fā)光行為

在檢測池中先加入5mmol·L－1Ru（bpy溶液進行循環(huán)伏安掃描，記錄電極電流和電化學發(fā)光曲線。加入3.4mg·L－1石斛堿溶液后，再進行循環(huán)伏安掃描，記錄電極電流和電化學發(fā)光曲線，結果見圖1。

圖1 循環(huán)伏安圖（a）和電化學發(fā)光曲線（b）Fig.1 Cyclic voltammograms（a）and the profile of electrochemiluminescence（b）

由圖1可知：三聯(lián)吡啶釕只有較小的電極電流和弱的電化學發(fā)光信號；當加入石斛堿后，電極電流和電化學發(fā)光信號都得到明顯的增強?；谑鷫A對三聯(lián)吡啶釕的電化學發(fā)光的增強作用，可建立毛細管電泳－電化學發(fā)光法測定石斛堿的含量。

2.2 檢測條件的選擇

2.2.1 檢測電位

采用恒電位法在1.0～1.35V（vs.Ag／AgCl）內(nèi)考察檢測電位對電化學發(fā)光（ECL）強度的影響，結果見圖2。

由圖2可知：當檢測電位升至1.17V時，石斛堿的ECL強度最大。因此，試驗選擇1.17V作為檢測電位。

圖3 Ru（bpy濃度對電化學發(fā)光強度的影響Fig.3 Effeet of concentration of Ru（bpy on ECL intensity

2.2.3 運行緩沖溶液的濃度和酸度

試驗考察了5～30mmol·L－1內(nèi)的運行緩沖溶液對ECL強度的影響，結果見圖4。

由圖4可知：隨著運行緩沖溶液濃度的增大，ECL強度逐漸增大；當其濃度為10mmol·L－1時，ECL強度達到最大；濃度高于10mmol·L－1時，ECL強度逐漸減小。因此，試驗選擇10mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液為運行緩沖溶液。

緩沖溶液的酸度也會影響毛細管電泳的分離效果和ECL強度，影響分析物的電離度，還會影響電滲流（EOF）的大小。試驗考察運行緩沖溶液在pH 3.50～8.50內(nèi)對ECL強度的影響，結果見圖5。

圖4 運行緩沖溶液濃度對電化學發(fā)光強度的影響Fig.4 Effect of concentration of the running buffer solution on ECL intensity

圖5 運行緩沖溶液酸度對電化學發(fā)光強度的影響Fig.5 Effect of acidity of the running buffer solution on ECL intensity

由圖5可知：當運行緩沖溶液pH為5.13時，ECL強度最大。因此，試驗選擇pH 5.13的10mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液為運行緩沖溶液。

2.2.4 檢測池中緩沖溶液的濃度和酸度

固定檢測池中磷酸鹽緩沖溶液濃度為60mmol·L－1，考察其 pH 在6.00～9.50內(nèi)對ECL強度的影響，結果見圖6。

由圖6可知：pH 為6.00～8.10時，ECL強度隨檢測池中磷酸鹽緩沖溶液pH增大而增大；pH為8.10～9.50時，ECL強度隨pH 增大而減小。因此，試驗選擇pH 8.10的磷酸鹽緩沖溶液。

選用pH 8.10磷酸鹽緩沖溶液，考察其濃度在50～90mmol·L－1內(nèi)對ECL強度的影響，結果見圖7。

由圖7可知：當檢測池中磷酸鹽緩沖溶液濃度為70mmol·L－1時，ECL強度達到最大。因此，試驗選擇檢測池中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為70mmol·L－1。

圖2 檢測電位對電化學發(fā)光強度的影響Fig.2 Effect of detection potential on ECL intensity

2.2.5 分離電壓和進樣時間

試驗考察了分離電壓在10～18kV內(nèi)對ECL強度的影響。結果表明：當電壓在10～15kV內(nèi)逐漸升高時，ECL強度逐漸增大；當分離電壓高于15kV時，基線噪聲大。因此，試驗選擇分離電壓為15kV。

采用電動進樣，選擇進樣電壓為10kV，考察了進樣時間在5～15s內(nèi)對ECL強度的影響。結果表明：隨著進樣時間的增加，ECL強度逐漸增大；當進樣時間超過10s時，ECL強度增長緩慢且偏離線性、有拖尾現(xiàn)象。因此，試驗選擇進樣時間為10s。

圖6 檢測池中磷酸鹽緩沖溶液酸度對電化學發(fā)光強度的影響Fig.6 Effeet of acidity of PBS in detection cell on ECL intensity

圖7 檢測池中磷酸鹽緩沖溶液濃度對電化學發(fā)光強度的影響Fig.7 Effeet of concentration of PBS in detection cell on ECL intensity

2.3 標準曲線和檢出限

在試驗條件下，石斛堿質量濃度在1.0～100mg·L－1內(nèi)與其峰面積呈線性關系，線性回歸方程為y＝374.9 x－85.81（y為ECL信號的峰面積，x為石斛堿的質量濃度），相關系數(shù)為0.999 7。

以3倍信噪比計算方法的檢出限（3S／N）為0.045mg·L－1。

2.4 樣品分析與加標回收試驗

按試驗方法測定金釵石斛樣品中的石斛堿，對照品及樣品的電泳圖見圖8。

圖8 毛細管電泳圖Fig.8 Capillary electrophoresis charts

圖8 曲線3為金釵石斛樣品的電泳圖，圖中只有一個峰，與對照品的出峰時間一致，且加入石斛堿標準溶液后峰信號增強，見圖8曲線2，與石斛堿對照品電泳圖（圖8曲線1）進行比較可知，樣品譜峰為石斛堿。經(jīng)計算，該批金釵石斛中石斛堿質量分數(shù)為0.32%。

取已知含量的樣品提取液，按試驗方法進行加標回收試驗，測定值與回收率結果見表1。

表1 樣品分析結果和回收試驗結果（n＝5）Tab.1 Results of tests for sample analysis and recovery（n＝5）

本工作采用毛細管電泳－電化學發(fā)光法測定金釵石斛中石斛堿的含量，方法簡單、快速，與藥典規(guī)定的測定方法相比，本方法具有進樣量少、分析速率快、靈敏度高、設備低廉、裝置及操作簡單等優(yōu)點。

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