輔助生殖技術(shù)對(duì)試管嬰兒活產(chǎn)率影響的研究進(jìn)展

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(1.空軍工程大學(xué)校務(wù)部門診部，陜西 西安 710038；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710038)

自1978年世界上第一位試管嬰兒誕生以來(lái)，關(guān)于輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)其中一個(gè)重要問(wèn)題是其相對(duì)較低的每周期活產(chǎn)率。根據(jù)2009年在歐洲人類生殖與胚胎協(xié)會(huì)(ESHRE)登記的50多萬(wàn)名試管嬰兒的信息，通過(guò)自身新鮮胚胎移植的女性，包括體外受精(in vitro fertilization，IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，其周期的活產(chǎn)率是22%，冷凍周期移植的活產(chǎn)率是15%，而通過(guò)贈(zèng)卵移植的女性，新鮮周期和冷凍周期移植的活產(chǎn)率達(dá)到了30%[1]。這些指標(biāo)明顯低于2009年由美國(guó)疾病控制中心(CDC)公布的相關(guān)數(shù)據(jù)。美國(guó)CDC公布的數(shù)據(jù)顯示，自身新鮮卵子或胚胎移植的活產(chǎn)率是37%，冷凍周期是30%，而通過(guò)贈(zèng)卵進(jìn)行新鮮周期和冷凍周期移植的活產(chǎn)率分別是55%和34%。ESHRE與美國(guó)CDC兩者公布數(shù)據(jù)差異的一部分原因可能是由于美國(guó)的ART臨床機(jī)構(gòu)公布ART結(jié)局時(shí)存在偏差[2]。但需要強(qiáng)調(diào)的是，這些數(shù)據(jù)主要是用作參考和了解大規(guī)模經(jīng)ART助孕人群的治療情況，而并非用來(lái)進(jìn)行系統(tǒng)分析和統(tǒng)計(jì)。

盡管近些年來(lái)ART周期移植的活產(chǎn)率有小幅度增高，但ART的成功率仍沒(méi)有達(dá)到令人滿意的程度。近十幾年許多研究者和研究機(jī)構(gòu)投入了大量人力、物力、財(cái)力用于研究超數(shù)排卵藥物治療，配子獲取和成熟技術(shù)，助孕技術(shù)，配子、胚胎的體外培養(yǎng)和冷凍保存，胚胎的優(yōu)選，胚胎移植的質(zhì)量控制，黃體期支持治療；卵巢過(guò)度刺激綜合征的預(yù)防及子宮內(nèi)膜的移植條件等其他因素[3]。從這些巨大的投入來(lái)看，ART技術(shù)本身就可能會(huì)影響周期活產(chǎn)率。

目前有許多文獻(xiàn)報(bào)道了ART對(duì)印記紊亂、印記基因甲基化水平及ART子代健康的潛在影響[4-6]，但是關(guān)于ART引起的表觀遺傳修飾改變對(duì)活產(chǎn)率的影響卻鮮有報(bào)道。ART治療過(guò)程中的各項(xiàng)體外操作和體外培養(yǎng)是在胚胎發(fā)生全基因表觀遺傳重編程這一特殊發(fā)育時(shí)期進(jìn)行的[7]。因此這些人為操作可能會(huì)導(dǎo)致胚胎的表觀遺傳修飾紊亂，進(jìn)而影響移植前胚胎的發(fā)育和ART周期活產(chǎn)率?，F(xiàn)就ART治療過(guò)程中的各項(xiàng)體外操作和體外培養(yǎng)對(duì)周期活產(chǎn)率影響的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1卵巢刺激

目前認(rèn)為，卵細(xì)胞在生長(zhǎng)階段將會(huì)進(jìn)行表觀遺傳標(biāo)記，這一過(guò)程發(fā)生在卵細(xì)胞減數(shù)分裂完成和排卵之前[8]，這提示超數(shù)排卵過(guò)程可能改變卵細(xì)胞的表觀遺傳修飾，進(jìn)而影響后續(xù)的ART活產(chǎn)率。超數(shù)排卵可能使卵細(xì)胞發(fā)育速度過(guò)快，卵細(xì)胞不夠成熟或者發(fā)生選擇性閉鎖，這種負(fù)面效果會(huì)影響卵細(xì)胞的質(zhì)量，并且可能會(huì)干擾卵細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中的甲基化印記和移植前胚胎甲基化印記的維持。在對(duì)小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，超數(shù)排卵對(duì)母源印記表達(dá)基因(H19)和父源印記表達(dá)基因(Snrpn，Peg3，Kcnq1ot1)的甲基化水平的影響存在劑量效應(yīng)關(guān)系[9]。此外，外源性激素藥物的應(yīng)用可能改變子宮環(huán)境，影響子宮內(nèi)膜的成熟[10]和參與正常子宮內(nèi)膜容受性基因的轉(zhuǎn)錄活性[11]，因此會(huì)干擾基因印記的維持。

最近一篇文獻(xiàn)綜述認(rèn)為，與女性卵細(xì)胞基因獲取印記相比，卵巢刺激對(duì)基因印記維持的不良效應(yīng)更加顯著[12]。但是，這項(xiàng)研究存在一定的缺陷，這些卵細(xì)胞均來(lái)自IVF或ICSI周期中質(zhì)量較差的卵細(xì)胞，這些卵細(xì)胞對(duì)人絨毛膜促性腺激素(hCG)的促進(jìn)卵子成熟作用反應(yīng)不佳，因此該文獻(xiàn)的結(jié)論可信度不高。

2配子低溫貯存

卵子和精子的低溫貯存均可能會(huì)影響受精之前的配子和移植前胚胎的基因印記。上述提到，卵細(xì)胞減數(shù)分裂完成和排卵之前，卵細(xì)胞在生長(zhǎng)階段將會(huì)發(fā)生表觀遺傳標(biāo)記。同樣地，竇狀小卵泡的全基因組轉(zhuǎn)錄活性沉默是發(fā)生在減數(shù)分裂完成之前[12-13]。同時(shí)，成熟的卵泡儲(chǔ)存了大量的mRNA，這些mRNA攜帶了許多在減數(shù)分裂期、受精時(shí)和移植前發(fā)育階段所需蛋白的編碼信息，包括卵細(xì)胞特異性DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1o)，這種酶在早期發(fā)育階段起著維持基因甲基化標(biāo)記的作用[14]。因此，卵細(xì)胞中儲(chǔ)存的信息對(duì)卵子成熟、受精和移植前胚胎發(fā)育階段，具有表觀調(diào)控的作用。

2.1卵子冷凍

與慢速冷凍卵子相比，卵子玻璃化冷凍解凍后更容易存活，具有較高的胚胎發(fā)育潛能。另外，經(jīng)過(guò)玻璃化冷凍的卵子，其受精率、移植率、妊娠率和活產(chǎn)率均接近于新鮮的卵子(針對(duì)的主要是年齡不超過(guò)34歲的女性)[15-16]。但另有一篇設(shè)計(jì)良好的配對(duì)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究認(rèn)為，玻璃化冷凍卵子行ICSI時(shí)的受精率較差，并且受精成功的胚胎發(fā)育至囊胚速度較慢，但是關(guān)于非整倍性囊胚的發(fā)生率和繼續(xù)妊娠率，玻璃化冷凍卵子組與非玻璃化對(duì)照組之間相近[17]。

關(guān)于玻璃化冷凍尚未成熟的人卵細(xì)胞的一些研究表明，與卵子體外成熟相比，玻璃化冷凍并沒(méi)有導(dǎo)致印記甲基化紊亂的風(fēng)險(xiǎn)增加[18]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，可編碼8個(gè)與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄本，它們?cè)诓ＡЩ鋬龊蠼鈨龅穆炎优c在人減數(shù)分裂中期(MⅡ)的新鮮卵子中含量相近[19]。但也有研究認(rèn)為，人MⅡ期卵子經(jīng)玻璃化冷凍和慢速冷凍后解凍均減少卵細(xì)胞中儲(chǔ)存的轉(zhuǎn)錄本水平[20]。

2.2精子冷凍

相反，精子印記標(biāo)記是一個(gè)逐步重建的過(guò)程，從胎兒發(fā)育時(shí)期的原始生殖細(xì)胞開始，到出生后精子減數(shù)分裂仍繼續(xù)進(jìn)行著[21]。男性精子的甲基化印記在A型精原細(xì)胞就已經(jīng)建立，并通過(guò)精子生成過(guò)程中DNMTs的mRNA表達(dá)和蛋白合成來(lái)維持其甲基化印記。精細(xì)胞基因組某些區(qū)域由組蛋白而非魚精蛋白包被，使得精子基因組結(jié)構(gòu)不至過(guò)于緊密，這有利于受精前基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。另外，精子的核組蛋白成分可以豐富有活性的逆轉(zhuǎn)座子，這種逆轉(zhuǎn)座子維持精子基因組某些區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活化狀態(tài)。精原細(xì)胞也具有翻譯活性，可以利用線粒體酶翻譯來(lái)自細(xì)胞核和線粒體的轉(zhuǎn)錄本[17]。

目前尚缺乏比較新鮮精子、慢速冷凍精子及玻璃化冷凍精子之間的ART活產(chǎn)率的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)。但是已了解到，慢速冷凍人類精子可以造成精子DNA碎片化，但精子慢速冷凍沒(méi)有影響精子一些母源和父源印記基因、重復(fù)序列，及與精子生成和男性不孕相關(guān)的特異性基因的甲基化模式[22]。相反，玻璃化冷凍精子和低溫貯存精子可造成精子DNA損傷及一些男性特異性基因和印記基因mRNAs的表達(dá)[23]。

3卵子體外成熟

正常排卵的女性[24]和多囊卵巢的女性[25]，當(dāng)其卵子經(jīng)過(guò)體外非刺激性成熟培養(yǎng)后，與IVF或ICSI周期的標(biāo)準(zhǔn)超數(shù)排卵相比，均會(huì)表現(xiàn)出較低的胚胎移植率和臨床妊娠率。多囊卵巢的女性卵子經(jīng)過(guò)體外成熟培養(yǎng)后，也會(huì)表現(xiàn)出較低的活產(chǎn)率[25]。卵子體外成熟引起的不良影響，可能與體外成熟培養(yǎng)期間基因印記標(biāo)記紊亂、基因轉(zhuǎn)錄異常和蛋白合成異常有一定的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，與體內(nèi)成熟的卵子相比，體外成熟培養(yǎng)的MⅡ期卵子儲(chǔ)存的基因轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了改變，而這些轉(zhuǎn)錄本與減數(shù)分裂、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞蛋白代謝過(guò)程具有相關(guān)性[26]。此外，一項(xiàng)關(guān)于恒河猴的研究認(rèn)為，未經(jīng)hCG處理的體外成熟培養(yǎng)的卵子與經(jīng)過(guò)hCG處理的體內(nèi)成熟卵子相比，兩組卵細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本水平僅有微小的差異性[27]。

4卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)

盡管在一些男性和不明原因的不孕夫婦中，ICSI相對(duì)于IVF，可以增加受孕率并降低受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)[28]。但是2010年美國(guó)CDC公布的關(guān)于ART總結(jié)報(bào)道中，認(rèn)為從2001至2010年期間，與無(wú)ICSI的ART周期相比，ICSI周期的移植活產(chǎn)率一直表現(xiàn)為較低，在新鮮贈(zèng)卵周期中，ICSI周期活產(chǎn)率是45%～55%，無(wú)ICSI的ART周期活產(chǎn)率是49%～57%，而在新鮮自身卵細(xì)胞移植周期中，ICSI周期活產(chǎn)率是32%～36%，無(wú)ICSI的ART周期活產(chǎn)率是35%～38%[2]。無(wú)ICSI的ART周期和ICSI周期這兩組活產(chǎn)率的微小差別，可能的原因是用于ICSI的精子是源自精液異常的男性患者，這些精子基因或表觀遺傳修飾存在異常。這種異常的精子作用于MII期卵子后可能會(huì)導(dǎo)致形成的胚胎表觀遺傳修飾缺陷，從而降低了ICSI周期的活產(chǎn)率。但是關(guān)于ICSI本身是否會(huì)引起胚胎表觀遺傳發(fā)生改變，有關(guān)這方面的研究結(jié)果尚存在較大的爭(zhēng)議。

有文獻(xiàn)報(bào)道，ICSI來(lái)源的胚胎和IVF來(lái)源的胚胎，兩者在形態(tài)評(píng)分較低的情況下，前者更容易表現(xiàn)出組蛋白3-賴氨酸-9(H3K9)低甲基化水平[29]。也有研究認(rèn)為，ICSI來(lái)源的和IVF來(lái)源的人類胚胎在全基因組的甲基化水平、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和印記基因的甲基化，兩者無(wú)顯著性差異[30]。關(guān)于小鼠的研究也認(rèn)為，ICSI來(lái)源的和IVF來(lái)源的囊胚，兩者全基因組表達(dá)情況明顯不同[31]。另一研究發(fā)現(xiàn)，ICSI來(lái)源的和IVF來(lái)源的小鼠胚胎，兩者在囊胚階段出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄組差異在新生兒期仍存在，到了8周后這種差異才消失，然而，還沒(méi)有證據(jù)顯示這種差異會(huì)通過(guò)自然交配遺傳給下一代[32]。

5胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)

一篇隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的系統(tǒng)綜述仍沒(méi)有確定出哪種胚胎培養(yǎng)基可以保證得到最好的ART臨床結(jié)局[33]。而且在被納入分析的研究中發(fā)現(xiàn)，在不同的培養(yǎng)基質(zhì)之間，其相應(yīng)的臨床妊娠率存在超過(guò)5%的差異，這也說(shuō)明了選擇良好的培養(yǎng)基對(duì)于IVF或ICSI周期成功率是有必要的。在移植前階段，人類囊胚處于不適宜的培養(yǎng)環(huán)境中，其全基因組表達(dá)模式會(huì)受到干擾[34]。但是在對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎盡管經(jīng)過(guò)不適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)，但是其產(chǎn)生的子代仍是健康的，因此認(rèn)為胚胎培養(yǎng)基可能不會(huì)對(duì)所有胚胎的全基因組表達(dá)產(chǎn)生干擾[35]。

6胚胎低溫貯存

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，與新鮮胚胎移植相比，凍融胚胎移植的臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率均較高，并可以降低與多胎妊娠無(wú)關(guān)的胎兒期和圍產(chǎn)期發(fā)病率，其原因可能是凍融胚胎周期的胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性較好[36-37]。但是，胚胎低溫貯存對(duì)ART活產(chǎn)率也有負(fù)面影響。2011年美國(guó)CDC公布的數(shù)據(jù)顯示，凍融胚胎的周期活產(chǎn)率是35.7%(2 500/7 143)，新鮮胚胎的周期活產(chǎn)率是54.8%(5 352/9 767)[2]。但是美國(guó)CDC的數(shù)據(jù)沒(méi)有詳細(xì)說(shuō)明胚胎低溫貯存的方式及胚胎是何時(shí)冷凍和移植的，而這一點(diǎn)很重要，原因是相對(duì)于卵裂期胚胎和慢速冷凍的胚胎，囊胚和玻璃化冷凍胚胎的妊娠率更高。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，胚胎低溫貯存可以改變DNA甲基化和基因表達(dá)，尤其是受精卵的慢速冷凍，明顯可以改變移植前與發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)[38]。

7胚胎活檢

來(lái)自1997至2008年的歐洲數(shù)據(jù)顯示，胚胎移植前基因診斷(PGD)和移植前基因篩選(PGS)周期的移植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率與單純ICSI周期相接近[39-40]。近年的一些前瞻性研究報(bào)道，與僅通過(guò)形態(tài)學(xué)評(píng)分選擇的囊胚相比，經(jīng)過(guò)活檢的整倍性囊胚選擇性移植后，能夠提高臨床移植率、持續(xù)移植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率[41-43]。但是胚胎活檢這一過(guò)程是否安全，目前還沒(méi)有定論，原因是這些經(jīng)過(guò)PGD或PGS的胚胎本身就存在本質(zhì)上的缺陷。

目前也有針對(duì)胚胎活檢技術(shù)本身是否對(duì)人類胚胎和胎兒發(fā)育產(chǎn)生影響的相關(guān)研究，結(jié)果認(rèn)為，胚胎活檢操作和一些物理化學(xué)干涉，不論多輕微，均有可能影響子代短期或長(zhǎng)時(shí)程健康。例如，在人類D2和D3的胚胎中，對(duì)第一和第二極體進(jìn)行激光活檢與未行活檢的胚胎相比，前者胚胎更容易出現(xiàn)發(fā)育遲滯和形態(tài)學(xué)缺陷[44]。與未行活檢胚胎或僅移除1個(gè)分裂球細(xì)胞相比，從8細(xì)胞階段移除2個(gè)分裂球細(xì)胞會(huì)降低囊胚形成率、生化妊娠率及活產(chǎn)率[45]。另外，當(dāng)胚胎發(fā)育至6～8個(gè)細(xì)胞階段時(shí)，移除其1個(gè)分裂球細(xì)胞，對(duì)該胚胎進(jìn)行時(shí)間追蹤分析發(fā)現(xiàn)，這一活檢過(guò)程并未影響胚胎的卵裂率，但是延長(zhǎng)了胚胎分裂的時(shí)間。因此，經(jīng)過(guò)活檢的胚胎在發(fā)育上出現(xiàn)延遲，并開始從透明帶脫離下來(lái)，而未活檢的胚胎以較小的形態(tài)在透明帶中逐漸孵育出來(lái)[46](因?yàn)榛顧z過(guò)程破壞了透明帶，所以活檢的胚胎無(wú)需同未活檢胚胎要經(jīng)歷透明帶孵出這一過(guò)程)。這種胚胎發(fā)育階段和透明帶脫離過(guò)程的不同步，可能導(dǎo)致D3時(shí)移除1個(gè)分裂球細(xì)胞進(jìn)行活檢的胚胎的臨床移植率和持續(xù)移植率下降[47]。

綜上所述，ART治療過(guò)程中的各項(xiàng)體外操作和體外培養(yǎng)均對(duì)ART周期活產(chǎn)率產(chǎn)生了一定的影響，而且這種影響可能是由于ART治療過(guò)程引起配子或胚胎的表觀遺傳修飾，使得配子或胚胎的基因表達(dá)出現(xiàn)異常，從而影響ART周期活產(chǎn)率。