條件性誘導轉基因斑馬魚卵細胞的凋亡和消融

周　莉， 王　芳, 劉　春, 梁惜梅， 姜　蘭,李凱彬

(1 中國水產科學研究院 珠江水產研究所， 廣東 廣州 510380； 2 上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306)

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條件性誘導轉基因斑馬魚卵細胞的凋亡和消融

周莉1，2， 王芳1, 劉春1, 梁惜梅1， 姜蘭1,李凱彬1

(1 中國水產科學研究院 珠江水產研究所， 廣東 廣州 510380； 2 上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306)

摘要：【目的】構建針對斑馬魚Danio rerio卵細胞的可誘導消融品系，并了解其卵巢組織在條件誘導下的去除規(guī)律和特性，為相關領域的應用提供材料基礎?！痉椒ā坷肨ol2 轉座系統(tǒng)建立卵細胞特異表達硝基還原酶(Nitroreductase，NTR)的轉基因斑馬魚品系；通過定期采樣，連續(xù)觀察、解剖、組織切片等方法研究甲硝唑(Metronidazole，Mtz)對成熟雌魚外觀及卵巢結構的影響；冰凍切片結合TUNEL檢測，了解條件性誘導對卵巢細胞凋亡的影響?！窘Y果】獲得囊胚細胞具特異熒光標記的轉基因魚，并形成穩(wěn)定遺傳品系。經Mtz誘導，該品系成熟雌魚卵巢結構逐步退化、萎縮，卵母細胞漸漸消融，提示NTR在卵細胞特異表達；檢測發(fā)現(xiàn)Mtz可導致卵細胞的凋亡，推測卵巢的組織變化為細胞凋亡所致；撤銷Mtz脅迫卵巢可再生并恢復生育功能，說明卵巢的消融過程是可逆的?！窘Y論】 獲得的轉基因斑馬魚可通過條件誘導實現(xiàn)卵巢消融與再生。

關鍵詞：斑馬魚； 卵巢； 卵細胞； 消融； nfsB基因; 硝基還原酶； 甲硝唑

硝基還原酶B (Nitroreductase B，nfsB)基因源于大腸埃希菌EscherichiacoliB，其編碼的硝基還原酶(Nitroreductase，NTR)蛋白能與包括甲硝唑(Metronidazole，Mtz)在內的含有硝基基團的化合物結合，產生具有細胞毒性的活性物質。該產物能夠有效地結合于DNA雙鏈上，抑制細胞核酸的合成，干擾細胞的生長，并最終導致細胞死亡[1-2]。因而，通過轉基因等技術使某種細胞特異表達NTR，在Mtz的誘導下可對特定器官或組織進行條件性消除，這已成為研究器官功能和再生的有效方法[3-8]。

斑馬魚Daniorerio個體小、養(yǎng)殖簡單、性成熟周期短、體外發(fā)育且胚體透明，相關的胚胎和遺傳學操作技術成熟，不僅成為重要的脊椎動物模式物種，同時也可作為模型動物用于水產動物基礎技術的相關研究[9]。NTR/Mtz系統(tǒng)在斑馬魚中也有所發(fā)展，在肝臟、心臟、胰腺等器官消融與再生的相關機制研究得到了良好應用[10]，與哺乳動物比較更便于對標記細胞的實時觀察和追蹤。

近年來，魚類生殖細胞移植技術有所發(fā)展，為魚類快速繁育和種子保存提供新的可能[11]。以成熟個體作為“代理親魚”(受體魚)時，通常選用三倍體個體或毒物處理親魚的方法以去除受體本身的生殖細胞[12-13]，利用轉基因技術構建魚類NTR/Mtz系統(tǒng)或為受體魚的制備提供新的思路和可能。研究者利用G4VP16/UAS系統(tǒng)構建了在卵巢特異表達硝基還原酶的轉基因斑馬魚，可人為控制卵巢的消融，對于魚類生殖系統(tǒng)發(fā)育與再生研究有重要意義[14]。在以上研究的基礎上，本研究利用Tol2轉座系統(tǒng)[15]構建斑馬魚卵細胞特異表達的轉基因載體，獲得轉基因斑馬魚品系[Tg(zpc:nfsB-mCherry)]，在透明帶蛋白C(Zona pellucida C,zpc)基因[16]啟動子控制下，該品系在卵巢組織特異表達NTR，Mtz作用可使其卵細胞凋亡，導致卵巢萎縮，或可作為“代理親魚”應用于異體生殖細胞移植研究。

1材料與方法

1.1試驗動物

斑馬魚Tuebingen(Tu)品系，養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水溫為28.5 ℃，人工控制光照明暗周期為14 h∶10 h。仔魚先以草履蟲作為開口飼料，逐漸添加豐年蝦及配合飼料，成魚主要喂食配合飼料，每天早晚各投料1次。

1.2主要試劑和儀器

所有限制性內切酶、pMD18-T、Taq酶 為TaKaRa公司產品；質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒為Omega公司產品；二甲基亞砜(DMSO)、Mtz為Sigma公司產品；mMESSAGE mMACHINE? Kit為Life公司產品；PCR 純化試劑盒為Qiagen公司產品；原位細胞凋亡檢測試劑盒為羅氏公司產品；體式熒光顯微鏡(SMZ1270)為Nikon公司產品；EVOS FL Auto為Life公司產品；顯微注射儀為NARISHIGE公司產品；斑馬魚養(yǎng)殖水槽為上海海圣生物實驗設備有限公司產品；LRH系列生化培養(yǎng)箱為上海一恒科技有限公司產品；冷凍切片機、RM2135型石蠟切片機為Leica公司產品。

1.3構建轉基因斑馬魚品系

1.3.1Tol2-zpc-nfsB-mCherry質粒構建以斑馬魚基因組為模板，通過PCR的方法擴增出zpc基因啟動子片段；分別以大腸埃希菌基因組DNA和含熒光蛋白基因mCherry序列的表達質粒(購自TaKaRa Clontech)為模板，通過PCR擴增出編碼nfsB和mCherry基因的CDS序列， 通過重疊 PCR，擴增nfsB-mCherry的CDS片段；以含SV40-poly(A)序列的質粒為模板，通過PCR擴增出SV40-poly(A)片段。利用在線分析工具BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析判斷上述擴增片段，無誤后將上述3個片段接入Tol2骨架中，構成Tol2-zpc-nfsB-mCherry質粒并測序驗證(所有引物見表1)。

1.3.2合成轉座酶 mRNAPCS質粒編碼轉座酶蛋白，該酶催化供體質粒發(fā)生轉座反應[17]。PCS質粒NotI酶內切線性化，純化試劑盒純化后，作為模板按mMESSAGE mMACHINE? Kit說明書，體外合成5′帽子結構的轉座酶 mRNA。

1.3.3顯微注射分光光度計測定Tol2-zpc-nfsB-mCherry質粒及轉座酶 mRNA的濃度，分別調整為200 ng·μL-1、100 ng·μL-1，等量混合，顯微注射至一細胞期斑馬魚胚胎，注射部位在卵黃囊與胚體交匯處，每個胚胎注射約為1～2 nL。

1.3.4轉基因品系篩選經注射胚胎孵化的斑馬魚為F0代。F0飼養(yǎng)至性成熟挑選母魚，與野生型公魚交配，F(xiàn)1胚胎發(fā)育至囊胚期時，于熒光顯微鏡下挑選出現(xiàn)特異紅色熒光的胚胎繼續(xù)培育。F1至2月齡時剪尾鰭，提取DNA，用針對nfsB基因特異引物(nfsBS, nfsBA,見表1)進行檢測，陽性個體用于品系構建或后續(xù)研究。取2～3月齡上述個體，卵巢組織于熒光顯微鏡下觀察其熒光標記狀況。

表1質粒構建及品系篩選PCR引物

Tab.1PCR primers for plasmids construction and strain screening

引物名稱引物序列(5'→3')zpcFCTCGAGCCTGAAAATCCCCATGzpcRGGTACCACCGGTATTGCCTGCT-GACTAAnfsBFACCGGTGCCACCATGGATAT-CATTTCTnfsBRTGCTCACCATCACTTCGGTTAAG-GTGmCherryFTTAACCGAAGTGATGGTGAG-CAAGGGmCherryRGGTACCGAATTCTTACTTGTA-CAGCTCGTSV40-poly(A)FGAATTCCCCCGGATCTTTGTGAAG-GAASV40-poly(A)RGGTACCTTGATGAGTTTGGACAAAnfsBSCATTCCACTAAGGCATTTGAnfsBAGTTTTGCGGCAGACGAGATT

1.4NTR/Mtz系統(tǒng)處理轉基因斑馬魚品系

5 mmol·L-1Mtz用養(yǎng)殖水配置,φ為0.2%的DMSO助溶，隨配隨用。20尾轉基因及4尾野生型雌性成魚，在1 L養(yǎng)殖水槽中飼養(yǎng)，野生型剪掉部分尾鰭，以便區(qū)分。試驗過程溫度保持在(28±1) ℃，并注意避光以免Mtz分解。整個試驗過程每天投喂1次，喂食結束，各組換用新鮮配置的Mtz溶液。

外觀及解剖觀察：采樣時間分別為轉基因魚在處理第0、 4、 8、 12天及撤銷Mtz后第10、 20天，野生型在處理第0、 12天，每次1尾，用Tricaine麻醉，觀察腹部大小變化；然后，將魚的單側腹部皮膚剪掉，暴露卵巢位置，觀察卵巢的大小、形態(tài)。組織切片觀察：用Bouns固定液固定處理0、 4、 8、 12 d轉基因魚，梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,橫向連續(xù)切片(厚度約3 μm)，H&E染色, 脫水封片，顯微鏡觀察卵巢結構及卵細胞變化。TUNEL細胞凋亡檢測：對處理1 d的野生型及轉基因魚用0.04 g·mL-1多聚甲醛固定，PBST沖洗，蔗糖脫水，取卵巢部位放入包埋劑，調整到合適位置，置于-20 ℃條件下，包埋劑凝固后進行冰凍切片(厚度約10 μm)。根據原位細胞凋亡檢測試劑盒說明對冰凍切片進行TUNEL細胞凋亡檢測。

2結果與分析

2.1獲得Tg(zpc:nfsB-mCherry)轉基因斑馬魚

對每個片段測序，斑馬魚zpc啟動子長416 bp，nfsB-mCherry融合蛋白cDNA序列長1 362 bp，SV40-poly(A)加尾信號長833 bp(圖1A)，通過在線分析工具 BLAST對測序結果進行核苷酸和氨基酸的序列比對分析，與預期完全吻合,并接入Tol2，形成Tol2-zpc-nfsB-mCherry轉基因表達載體(圖1B)。

篩選了20尾F0雌魚，其中2尾產的胚胎囊胚期能觀察到紅色的特異熒光(圖1D)；在 2尾魚產的400多顆卵中，共獲得陽性胚胎76個；陽性個體培育至2月齡，通過PCR鑒定確認其已轉入nfsB基因；選取部分經上述鑒定魚，取卵巢，熒光下觀察到卵巢組織有明顯的特異熒光(圖1F)。

A： 轉基因表達元件；B： Tol2轉基因表達載體；C、D分別為轉基因 F1代囊胚期自然光與熒光下圖片; E、F分別為轉基因 F1代性成熟卵巢自然光與熒光下圖片；標尺=50 μm。

圖1轉基因魚質粒構建及熒光觀察

Fig.1Transgenic fish plasmid construction and fluorescence observation

2.2轉基因斑馬魚卵巢消融與再生的外觀及解剖觀察

轉基因魚Mtz處理之前卵巢中卵粒充盈，形態(tài)、大小與野生型類似(圖2A)；4 d腹部外觀大小基本無變化，卵巢輕度萎縮，卵粒輕微塌陷(圖2B)； 8 d魚腹部明顯變小，卵巢嚴重萎縮，卵粒變小，數(shù)量也明顯減少(圖2C)； 12 d魚腹部變小更加明顯，甚至有些凹陷，基本沒有卵粒，整個消融的卵巢形成明顯的空腔(圖2D)；撤銷Mtz，恢復10 d魚腹部開始隆起，解剖發(fā)現(xiàn)卵粒開始增加(圖2E)； 20 d魚腹部已經恢復到浸泡之前的大小，解剖發(fā)現(xiàn)卵粒基本恢復正常(圖2F)。Mtz浸泡12 d的野生型魚外觀大小基本無變化，解剖發(fā)現(xiàn)卵巢中充滿粗大卵粒(圖2G)。

A：Tg(zpc:nfsB-mCherry)魚處理前；B、C、D分別為Tg(zpc:nfsB-mCherry)魚浸泡5 mmol·L-1Mtz 4、 8、 12 d； E、F分別為Tg(zpc:nfsB-mCherry)魚撤銷Mtz 恢復10、 20 d； G： 野生型魚浸泡5 mmol·L-1Mtz 12 d。

圖2轉基因斑馬魚卵巢消融與再生的外觀及解剖圖

Fig.2External appearance and internal ovarian morphology of Tg(zpc:nfsB-mCherry) female during the process of ovarian ablation and regeneration

2.3轉基因斑馬魚卵巢消融的石蠟切片H&E染色

未經 Mtz處理Tg(zpc:nfsB-mCherry)成魚卵巢存在第II、 III、 IV時相細胞，以IV時相細胞為主，第IV時相卵母細胞已充分發(fā)育,呈圓球形,細胞質中充滿粗大的卵黃顆粒(圖3A)；Mtz處理3 d后，第IV時相卵母細胞出現(xiàn)萎縮，數(shù)量減少，其余細胞變化不明顯(圖3B)；8 d時，第III時相、 IV時相細胞皺縮，導致卵巢結構變得松散，邊緣不整(圖3C)；12 d時，各時期細胞基本消失，僅存極少數(shù)第II時相細胞，可見卵巢的支撐結構(圖3D)。

II、III、IV分別代表第II、III、IV時相卵母細胞; A為Tg(zpc:nfsB-mCherry)魚Mtz處理前；B、C、D分別為Tg(zpc:nfsB-mCherry)魚浸泡5 mmol·L-1Mtz 4、 8、 12 d；標尺=100 μm。

圖3轉基因斑馬魚卵巢消融的石蠟切片H&E染色

Fig.3Images of Tg(zpc:nfsB-mCherry) female ovarian paraffin sections with H&E staining during ovarian ablation

2.4轉基因斑馬魚卵巢消融的TUNEL檢測

通過TUNEL細胞凋亡檢測，凋亡細胞DNA斷裂產生的大量黏性3′—OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下，被熒光素染成綠色小點。熒光顯微鏡下，雖然對照組(圖4B)和處理組(圖4D)均可觀察到綠色熒光，但處理組的熒光強度遠比對照組明顯，且密集分布于卵殼位置，勾勒出卵細胞的基本形狀，說明經Mtz處理1 d的轉基因魚卵細胞透明帶位置出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡。對照組也能觀察到微弱的熒光，表明卵巢作為代謝活躍的器官，存在正常的細胞凋亡現(xiàn)象。而轉基因魚在zpc啟動子驅動下于透明帶特異表達NTR，與Mtz結合導致大量卵細死亡；隨著Mtz作用時間增加，凋亡細胞為組織重新吸收利用，卵巢便成為由支持細胞組成的空腔結構(圖 2D)。

A、B分別為野生型魚卵巢自然光、熒光圖片；C、D分別為Tg(zpc:nfsB-mCherry)魚卵巢自然光、熒光圖片；標尺=100 μm。

圖4轉基因斑馬魚Mtz (5 mmol·L-1)處理1 d卵巢的TUNEL檢測

Fig.4TUNEL detection of Tg(zpc:nfsB-mCherry) female ovarian after 1 d exposure to Mtz (5 mmol·L-1)

3討論與結論

本研究獲得了穩(wěn)定遺傳的轉基因斑馬魚品系Tg(zpc:nfsB-mCherry)，該品系可在卵巢組織特異表達NTR，因而可通過Mtz脅迫的方法實行對卵巢的條件性去除。Mtz作為一種抗厭氧菌和殺原蟲藥物，大劑量或長時間作用或對魚體造成不良影響，故其作用時間和劑量是條件去除過程的關鍵問題[18]。斑馬魚關于Mtz的使用濃度相關報道集中于5～10 mmol·L-1[19-20]，筆者也就Mtz對幼魚的毒性進行預試驗，發(fā)現(xiàn)10 mmol·L-1時短暫浸泡對斑馬魚的影響不太明顯，而長期脅迫甚至可導致少量魚的死亡，故若使用10 mmol·L-1的高濃度時應盡量縮短浸泡時間。

本研究主要針對成魚卵巢，考慮到該器官相對于魚體而言是較大的成熟組織，故采用低濃度(5 mmol·L-1)長時間(12 d)的浸泡，也取得了預期的效果。Curado等[10]用10 mmol·L-1的Mtz作用由不同啟動子驅動NTR的轉基因斑馬魚幼魚，24 h后心臟、胰腺、肝臟等出現(xiàn)細胞消融，并伴隨相應的功能缺陷；White等[14]采用5 mmol·L-1的 Mtz作用轉基因動物，也可導致卵巢的條件性去除；Hsu等[19]也是用5 mmol·L-1的Mtz處理轉基因斑馬14 d，精巢被完全或部分破壞，這與筆者的試驗結果相吻合，說明5～10 mmol·L-1浸泡是較為合適的作用方式。本研究作用對象為成熟雌魚，Mtz的給藥方式除了浸泡，也可通過投喂方式給藥?？诜椒墒刽~體內Mtz保持合適濃度，減少體外高劑量藥劑對魚體鰓等組織的長期脅迫，可能是我們模型后續(xù)應用的更好選擇。

在哺乳動物上，透明帶除了作為受體防止多精入卵外，還能為卵細胞的發(fā)育提供營養(yǎng)，發(fā)育到一定階段的卵母細胞營養(yǎng)物質靠其微絨毛和放射冠細胞的突起伸入透明帶來獲取[21-22]。本研究獲得的轉基因魚在zpc啟動子驅動下于卵細胞透明帶特異表達NTR，在Mtz的作用初期，通過TUNEL檢測可發(fā)現(xiàn)卵細胞透明帶位置出現(xiàn)凋亡，推測NTR與Mtz形成復合物，結合細胞DNA雙鏈發(fā)揮功能。透明帶消融可能斷絕卵母細胞發(fā)育的物質來源，隨著卵細胞的逐漸消失造成整個卵巢的萎縮[23]。當撤銷Mtz的脅迫，斑馬魚恢復20 d后，外觀上卵巢基本恢復，30 d后與正常雄魚交配仍可產生健康后代(結果在文章未體現(xiàn))，表明由于環(huán)境中沒有Mtz，生殖相關干細胞發(fā)育成的卵細胞雖還表達NTR，但不會因復合物作用而凋亡，能逐漸發(fā)育成成熟卵細胞并恢復生殖功能。從目前研究分析，NTR/Mtz系統(tǒng)對成熟細胞的條件性去除都是可逆的，而針對于干細胞的消融可能對個體的影響更為復雜，因而，Mtz對我們獲得的轉基因品系發(fā)育早期的影響還值得進一步研究。

目前，提高魚類異體(種)生殖細胞移植成功和轉化效率可從供體和受體2方面入手：保障供體生殖細胞或干細胞的濃度、純度、活力等；有效移除受體自身功能細胞，減少此類細胞對發(fā)育的影響。以斑馬魚作為受體的相關研究中，通常采用Morpholino方法在胚胎期針對dnd、vasa等早期發(fā)育基因干擾斑馬魚原始生殖細胞(PGC)的形成以去除受體本身生殖細胞[24]。研究又發(fā)現(xiàn)，PGC的缺失或減少可使魚體趨向于雄性化發(fā)展[25]，故在以成魚作為受體的移植應用上或只能獲得雄魚個體，一定程度上限制了應用。本研究獲得的斑馬魚品系能條件性消融生殖系用的功能性細胞——卵細胞，但仍保留卵巢的支持結構，作為受體應可接受外來的生殖原細胞甚至于PGC，或可作為雌性受體系統(tǒng)發(fā)展，為魚類“代理親魚”技術的發(fā)展提供材料基礎和技術思路。

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【責任編輯 莊延,柴焰】

Conditionally induced apoptosis and ablation of transgenic zebrafish oocytes

ZHOU Li1,2, WANG Fang1, LIU Chun1, LIANG Ximei1, JIANG Lan1, LI Kaibin1

(1 Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China;2 College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract：【Objective】 To develop a transgenic zebrafish，Danio rerio, line in which oocyte ablation can be conditionally induced, study the characteristics of oocyte ablation, and provide materials for future reproduction studies.【Method】The Tol2 transposon system was used to generate a transgenic zebrafish line which expressed nitroreductase (NTR) enzyme under control of the oocyte-specific gene promoter. The effects of metronidazole (Mtz) on appearance of mature females and internal ovary structure were evaluated by regular sampling, continuous observation, dissection and tissue sectioning. Frozen sections stained by TUNEL were used to detect the induced oocyte apoptosis.【Result】A transgenic fish line with stable inheritance was obtained and its blastula cells showed specific mCherry fluorescence. Induced by Mtz, the transgenic mature female ovary gradually degenerated and atrophied, and the oocytes progressively ablated. The results indicated NTR expression in the oocytes. TUNEL detection confirmed that Mtz could induce oocyte apoptosis, leading to histological changes in the ovary. Furthermore, the ovarian ablation induced by Mtz was reversible. When the Mtz stress was withdrawn, the oocytes regenerated and the ovary restored its function.【Conclusion】The transgenic zebrafish obtained in this study can implement ovarian ablation and regeneration through conditional induction.

Key words：Danio rerio; ovary; oocyte; ablation; nfsB gene; NTR；Mtz

中圖分類號：Q954.43

文獻標志碼：A

文章編號：1001- 411X(2016)03- 0017- 06

基金項目：國家科技支撐計劃(2015BAI09B05)

作者簡介：周莉(1989—)，女，碩士研究生，E-mail:zhoulisdta@163.com；通信作者：李凱彬(1973—)，男，研究員，E-mail: likaibins@126.com

收稿日期：2015- 10- 15優(yōu)先出版時間：2016-04-15

優(yōu)先出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160415.1554.012.html

周莉， 王芳, 劉春，等.條件性誘導轉基因斑馬魚卵細胞的凋亡和消融[J].華南農業(yè)大學學報，2016,37(3):17- 22.