硝磺草酮降解菌HZ-2制劑固定化載體材料性能的比較

張晶晶， 楊孟然， 劉　婕， 蔣剛彪， 鐘國(guó)華

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院，廣東 廣州510642)

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硝磺草酮降解菌HZ-2制劑固定化載體材料性能的比較

張晶晶1， 楊孟然1， 劉婕1， 蔣剛彪2， 鐘國(guó)華1

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院，廣東 廣州510642)

摘要：【目的】研究改性蔗渣MSB、MSB-Mo、MSB-Cl對(duì)硝磺草酮降解菌HZ-2的降解能力的影響。【方法】以這3種改性蔗渣和活性炭為固定化載體，對(duì)固定化后菌制劑的降解性能進(jìn)行研究?！窘Y(jié)果】降解菌制劑培養(yǎng)48 h后，D600 nm均較高，表明MSB、MSB-Mo、MSB-Cl及活性炭均具備較強(qiáng)的固菌能力；培養(yǎng)3 d 后，以改性蔗渣為載體的固菌制劑對(duì)LB培養(yǎng)基中硝磺草酮的降解率高于85%，顯著優(yōu)于活性炭，其中改性蔗渣MSB-Mo效果突出，降解率達(dá)96.35%。添加葡萄糖輔料7 d后，這3種改性蔗渣對(duì)土壤中硝磺草酮的降解率均高于99%?！窘Y(jié)論】改性蔗渣MSB-Mo是固定降解菌株的最佳新型生物載體材料。

關(guān)鍵詞：硝磺草酮； 改性蔗渣； 載體材料； 降解能力

硝磺草酮(甲基磺草酮)，化學(xué)名稱為2-[4-(甲基磺?；?-2-硝基苯?；鵠-3-環(huán)己二酮，是一類能夠抑制羥基苯基丙酮酸酯雙氧化酶(HPPD),使雜草產(chǎn)生白化癥狀的新型三酮類除草劑，適用于苗前與苗后[1]。硝磺草酮是在玉米田上單獨(dú)使用或與阿特拉津和氯乙酰胺混用的廣譜性除草劑，對(duì)環(huán)境友好[2]。但是隨著硝磺草酮使用量和施用頻數(shù)增加，對(duì)環(huán)境的潛在影響逐步體現(xiàn)[3]。因此，研究硝磺草酮的生物修復(fù)技術(shù)，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)具有重要的前瞻意義。

微生物分解除草劑在農(nóng)藥降解中占很大比重[4],生物修復(fù)高效、安全、花費(fèi)少、應(yīng)用范圍廣[5],但菌株田間使用率低和田間不確定因素多，降解菌制劑開發(fā)力度小、難度大。微生物的固定化技術(shù)可以將優(yōu)勢(shì)菌種固定，使其保持較高的活性，而且可以反復(fù)、連續(xù)利用，從而提高降解效率[6-8]，具有單位體積內(nèi)微生物細(xì)胞密度高、反應(yīng)迅速、穩(wěn)定性高、耐毒害能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[9]。目前，蔗渣已成功運(yùn)用于造紙工業(yè)、乙醇、氫氣和木糖醇生產(chǎn)、食用菌栽培、高性能吸附材料開發(fā)等[10]。蔗渣在生產(chǎn)乙醇和木糖醇的過程中，是將目標(biāo)微生物或細(xì)胞固定在蔗渣上，然后通過化學(xué)反應(yīng)生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物[11]。已有研究[12]表明利用蔗渣和海綿作為載體的固定化微生物除油效果良好。選用蔗渣作為農(nóng)藥殘留降解菌制劑的載體材料，制作方便、資源豐富、成本低廉、商業(yè)化前景廣闊，具有不可小覷的發(fā)展?jié)摿?。本文篩選并評(píng)價(jià)了MSB、MSB-Mo、MSB-Cl及活性炭對(duì)降解菌HZ-2的固菌能力，以期為固定化微生物技術(shù)在農(nóng)藥降解方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株:以硝磺草酮為碳源的菌株HZ-2，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理研究室從農(nóng)藥廠廢水處理池活性污泥中篩選而得。根據(jù)其生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析，將該菌株鑒定為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus[13]。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1；固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基添加15 g·L-1的瓊脂。

改性蔗渣MSB、MSB-Mo及MSB-Cl由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院蔣剛彪教授課題組提供，具體改性方法見文獻(xiàn)[14]。活性炭40和100目，購(gòu)自上海海諾炭業(yè)有限公司。

藥劑：硝磺草酮標(biāo)準(zhǔn)品，純度98%(w)，由廣東省佛山市盈輝作物科學(xué)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1降解菌的培養(yǎng)與降解菌制劑的制備將菌株HZ-2接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃ 恒溫培養(yǎng)36 h，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落，無菌操作條件下接種到LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃ 、180 r·min-1搖床培養(yǎng)，4 800 r·min-1離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌后稀釋成不同濃度的菌懸液。取0.1 g載體材料，加入108cfu·mL-1菌液2 mL后密封，30 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)，掛膜24 h后離心，無菌水沖洗沉淀，20 ℃真空烘至近干。多次制備密封待用。

1.2.2載體中降解菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)測(cè)定將固有降解菌的載體材料0.1 g置于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，用同等質(zhì)量的載體材料處理及108cfu·mL-1菌液2 mL處理為對(duì)照，30 ℃ 、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)0、24、48 h后的D600 nm。

1.2.3硝磺草酮在LB培養(yǎng)基中添加回收率的測(cè)定取滅菌新鮮LB培養(yǎng)基50 mL，添加硝磺草酮母液，使其最終質(zhì)量濃度分別為1、5、10 mg·L-1,3個(gè)重復(fù)。加二氯甲烷30 mL后超聲20 min，混合液移入分液漏斗，用30 mL二氯甲烷分2次沖洗，沖洗液一并移入分液漏斗，搖勻，劇烈振蕩3～5 min，靜置分層，下層經(jīng)20 g無水硫酸鈉過濾至圓底燒瓶，重復(fù)萃取3次，濾液并入燒瓶，45 ℃濃縮至近干，用乙腈分3次洗滌圓底燒瓶并定容至10 mL，最后取2 mL 經(jīng) 0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾至進(jìn)樣瓶，HPLC法檢測(cè)。

1.2.4降解菌制劑活性的初步測(cè)定將固菌制劑0.1 g 置于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中初始硝磺草酮50 mg·L-1，震蕩培養(yǎng)3 d后，離心取上清液，HPLC法檢測(cè)。

HPLC檢測(cè)參照文獻(xiàn)[13]：HP-1100型高效液相色譜工作站(Agilent，美國(guó))，C18反相柱(Kromasil C18 4.6 mm×150 mm, 5 μm, 100 A)，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(w為0.05%的磷酸溶液)=55∶45，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5硝磺草酮在土壤中添加回收率的測(cè)定取20 g土壤于250 mL三角瓶，添加硝磺草酮母液，使其最終濃度為1、5、10 mg·kg-1,3個(gè)重復(fù)，加入60 mLV(蒸餾水)∶V(乙腈) =1∶5的混合溶液超聲30 min，過濾至裝有5 g氯化鈉的具塞量筒，震蕩分層，取上清液25 mL于圓底燒瓶，55 ℃濃縮至近干，用乙腈分3次洗滌圓底燒瓶并定容至10 mL，最后取2 mL 溶液經(jīng) 0.45 μm有機(jī)濾膜過濾至進(jìn)樣瓶，待HPLC法檢測(cè)。

1.2.6降解菌制劑在土壤中的活性測(cè)定取10 g滅菌土壤于150 mL三角瓶，添加硝磺草酮母液，使其最終濃度為100 mg·kg-1。加入0.1 g降解菌制劑和10 mL無菌水后震蕩均勻，以直接加入菌液的土壤處理為對(duì)照，封閉震蕩培養(yǎng)5 d。HPLC法測(cè)定土壤中硝磺草酮的殘留量，計(jì)算降解率。

1.2.7添加葡萄糖對(duì)制劑降解活性的影響在每0.1 g降解菌制劑中添加5 mg葡萄糖，加入10 g滅菌土壤置于150 mL三角瓶，加入10 mL無菌水后震蕩均勻，使土壤硝磺草酮終濃度為50 mg·kg-1，封閉震蕩培養(yǎng)，測(cè)定3、5、7 d后土壤中硝磺草酮的殘留量，計(jì)算降解率。

2結(jié)果與分析

2.1載體材料的固菌增殖能力的初步評(píng)價(jià)

將降解菌HZ-2分別固定于改性蔗渣(MSB、MSB-Mo及MSB-Cl)以及活性炭(40和100目)5種載體材料中，分別測(cè)定培養(yǎng)0、24、48 h后的D600 nm(菌液稀釋20倍)(表1)。結(jié)果表明，開始培養(yǎng)時(shí)，D600 nm差異較大，這可能是由于各種載體材料吸光度不同；培養(yǎng)24 h后，5種供試載體材料D600 nm均顯著提高；培養(yǎng)48 h后， 5種材料固菌后D600 nm均較高，說明這些材料均具備較強(qiáng)的固菌能力，降解菌均得到了進(jìn)一步的增殖，改性蔗渣MSB-Mo、MSB-Cl的固菌能力稍強(qiáng)于其他載體材料。

表1供試載體材料固菌后的D600 nm

Tab.1D600 nmof tested carrier material after immobilizing bacteria

固菌材料0h24h48hMSB0.037d0.290cd0.400deMSB-Mo0.095a0.350b0.470abMSB-Cl0.085b0.400a0.485a活性炭40目0.038d0.316bc0.373e活性炭100目0.056c0.339bc0.423cdCK0.021e0.330bc0.430bcd

1)同列數(shù)據(jù)中后凡具有一個(gè)相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05，DMRT法)。

2.2硝磺草酮在LB培養(yǎng)基和土壤中的添加回收率

硝磺草酮在LB培養(yǎng)基中的添加質(zhì)量濃度為1、5和10 mg·L-1時(shí)，添加回收率分別為108.24%、91.96%和91.79%，變異系數(shù)分別為1.74%、2.84%和0.60%,均小于5.00%；硝磺草酮在土壤中的添加濃度為1、5、10 mg·kg-1時(shí)，添加回收率分別為82.32%、82.74%和88.75%，變異系數(shù)分別為0.96%、3.75%和1.62%,均小于5.00%，符合殘留檢測(cè)要求，表明試驗(yàn)所采用的LB培養(yǎng)基和土壤中提取硝磺草酮的方法穩(wěn)定可靠。

2.3降解菌制劑對(duì)LB培養(yǎng)基和土壤中硝磺草酮的降解能力

改性蔗渣固菌制劑對(duì)硝磺草酮的降解效果明顯，降解率均大于85%?；钚蕴坎牧现苿┙到饴曙@著低于改性蔗渣材料，這可能與蔗渣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)。蔗渣富含纖維素、疏松多孔，對(duì)降解菌有良好的固定能力；而且蔗渣本身具有強(qiáng)烈的吸附作用，能吸附土壤中的重金屬[15]。

在這3種改性蔗渣材料中， MSB-Mo、MSB-Cl效果突出，降解率分別達(dá)96.35%和93.22%，顯著高于MSB的89.78%，更顯著優(yōu)于活性炭載體處理組(40目為64.05%和100目為43.22%)的降解率。其中，MSB-Mo相較于MSB-Cl效果更好，故后續(xù)其他試驗(yàn)未再研究活性炭的處理效果，而以3種改性蔗渣材料作為研究對(duì)象。

降解菌制劑對(duì)土壤中硝磺草酮的降解能力見圖1。結(jié)果表明，處理5 d后，各處理降解率均不足30%，不能滿足實(shí)際生產(chǎn)的要求。在LB培養(yǎng)基和土壤條件下硝磺草酮降解率差異較大的原因，可能是載體材料未能提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降解菌不能及時(shí)繁殖，降解菌數(shù)量不足而導(dǎo)致降解率低下。

柱子上凡具有一個(gè)相同字母者,表示差異不顯著(P>0.05,DMRT法)。

圖1載體固菌制劑對(duì)土壤硝磺草酮的降解作用

Fig.1Degradation of mesotrione in soil by immobilized microbial preparations

2.4葡萄糖對(duì)改性蔗渣載體固菌制劑降解活性的影響

在上述載體固菌制劑中添加葡萄糖，使制劑初步具備菌株基本營(yíng)養(yǎng)條件，為其在土壤中定植、生長(zhǎng)、抵御其他微生物的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)等提供可能。從圖2中可以看出，處理3 d后，硝磺草酮降解率達(dá)50%以上，處理7 d后，改性蔗渣MSB、MSB-Mo和MSB-Cl為載體的降解菌制劑對(duì)土壤硝磺草酮的降解率分別為99.22%、99.49%和99.41%，說明添加葡萄糖能提高改性蔗渣作為載體的降解菌制劑的降解能力。結(jié)合降解菌制劑對(duì)LB培養(yǎng)基中硝磺草酮的降解能力影響的結(jié)果，改性蔗渣MSB-Mo是固定降解菌株的最佳載體材料。

相同時(shí)間、不同柱子上凡具有一個(gè)相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05,DMRT法)。

圖2添加葡萄糖后改性蔗渣固菌制劑對(duì)土壤硝磺草酮的降解作用

Fig.2Degradation of mesotrione in soil by modified bagasse as immobilized microbial preparations after adding glucose

3討論與結(jié)論

固定化是一種常用的技術(shù)手段，固定化微生物技術(shù)可以提高微生物密度、加快微生物生化反應(yīng)速率和提高微生物對(duì)環(huán)境的耐受力[16]。載體的種類是決定固定化微生物性能的關(guān)鍵因素之一[17]。從本研究來看，改性蔗渣對(duì)硝磺草酮的降解率顯著優(yōu)于活性炭。天然疏松多孔的蔗渣不僅能作為微生物的附著載體提供微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且還能充當(dāng)疏松劑提高土壤的透氣性，可用于微生物的固定。國(guó)內(nèi)外已有研究[18-20]將蔗渣載體應(yīng)用于微生物發(fā)酵、生產(chǎn)丁醇以及降解苯酚等，但鮮見其應(yīng)用于農(nóng)藥降解殘留的研究。本研究結(jié)果表明，改性蔗渣MSB、MSB-Mo、MSB-Cl固菌后與50 mg·L-1硝磺草酮在LB培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3 d，對(duì)硝磺草酮的降解率均高于80%，顯著優(yōu)于活性炭；葡萄糖的適量添加可顯著加強(qiáng)載體固菌制劑降解土壤硝磺草酮的效果，改性蔗渣MSB、MSB-Mo、MSB-Cl載體制劑按照質(zhì)量比5%的比例添加葡萄糖，7 d后對(duì)土壤中起始50 mg·kg-1硝磺草酮的降解率均高于99%。這些結(jié)果可為將蔗渣開發(fā)成環(huán)境污染物降解制劑的載體材料提供重要參考。今后將進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制和應(yīng)用技術(shù)等。

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【責(zé)任編輯霍歡】

Pexformance comparison of different carrier materials for immobilization of mesotrione-degrading strain HZ-2

ZHANG Jingjing1,YANG Mengran1,LIU Jie1,JIANG Gangbiao2,ZHONG Guohua1

(1 College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2 College of Materials and Energy, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To evaluate the effect of modified bagasse (MSB, MSB-Mo and MSB-CI) on the immobilization of mesotrione-degrading bacteria strain HZ-2.【Method】Three types of modified bagasse and activated carbon were selected as the carrier candidates for the bacterial immobilization， and the degradation abilities of immobilized composites were examined.【Result】After 48 hours culture, the high D600 nmvalues indicated that modified bagasse(MSB, MSB-Mo and MSB-CI) and activated carbon had strong abilities to immobilize bacteria. More than 85% of mesotrione in LB medium was degraded using modified bagasse as a carrier after 3 days of culture, which was higher than the results of activated carbon. MSB-Mo composite had the best degradation performance with a degradation rate of 96.35%.Moreover,mesotrione in soil was degraded over 99% after 7 days by adding glucose as support nutrient to the modified bagasse. 【Conclusion】 Modified bagassse MSB-Mo is the most available carrier material, which demonstrates the highest potential of being a new biological carrier material for immobilization of mesotrione-degrading bacteria strain.

Key words：mesotrione; modified bagasse; carrier material; degradation ability

中圖分類號(hào)：S482.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001- 411X(2016)03- 0086- 04

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B020206003)

作者簡(jiǎn)介：張晶晶(1993—)，女，碩士研究生，E-mail：784224089@qq.com；通信作者：鐘國(guó)華(1973—)，男，教授，博士，E-mail: guohuazhong@scau.edu.cn

收稿日期：2015- 07- 05優(yōu)先出版時(shí)間：2016-04-15

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160415.1554.010.html

張晶晶， 楊孟然， 劉婕，等.硝磺草酮降解菌HZ-2制劑固定化載體材料性能的比較[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(3):86- 89.