槲皮素對慢性酒精暴露小鼠肝臟自噬的調(diào)控

李艷艷，于 微，馮里茹，郭小萍，姚 平，王 俊

(1. 深圳市慢性病防治中心理化檢驗科，廣東 深圳 518020；2. 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，湖北 武漢 430030)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于攝入過量酒精而導(dǎo)致肝臟損害的一系列病變， ALD 已成為世界范圍內(nèi)導(dǎo)致慢性肝病的重要原因[1]。ALD發(fā)病早期尚可逆轉(zhuǎn)，因此，研究ALD的早期發(fā)病機制及干預(yù)靶點，對于ALD的預(yù)防及治療具有非常重要的意義[2]。

研究表明，在ALD的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬作用扮演著重要的角色[3]。在自噬過程中，溶酶體與自噬體融合以及自噬性降解是自噬流(autophagic flux)順利進行的重要保證。然而，由于溶酶體脆弱的抗氧化系統(tǒng)，溶酶體對氧化應(yīng)激異常敏感。酒精代謝過程中會導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生嚴重的氧化應(yīng)激，推測酒精暴露可能導(dǎo)致溶酶體膜損傷，進而影響自噬作用。研究也發(fā)現(xiàn)，溶酶體損傷所致的自噬損害在酒精相關(guān)性疾病中發(fā)揮重要的作用。長期酒精暴露會引起心肌細胞溶酶體損傷，從而導(dǎo)致自噬體異常積累，加重酒精性心臟損傷[4]。因此，緩解溶酶體的損傷，恢復(fù)溶酶體的自噬功能可能是ALD防治的新靶點。

槲皮素是分布于紅洋蔥、蘋果、茶葉等植物性食物中一種黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、保護ALD等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[5]。雖然槲皮素的生物利用度較低，但其可通過參與生物體內(nèi)多種生理功能的調(diào)控而放大并發(fā)揮其強大的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過調(diào)節(jié)自噬作用發(fā)揮對多種疾病的保護作用[6]。但目前尚沒有在溶酶體自噬水平上探討槲皮素緩解ALD的潛在機制。因此，本文旨在探討長期酒精暴露對肝臟溶酶體自噬的影響及槲皮素拮抗效應(yīng)的相關(guān)機制。

1 材料

1.1實驗動物及飼料SPF級成年♂ C57BL/6J小鼠(18～20 g)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證號：No.11400700212179)。Lieber De Carli liquid液體飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2試劑槲皮素(≥0.95，Sigma)；質(zhì)量分數(shù)為0.025戊二醛固定液(谷歌生物)；血清ALT、AST檢測試劑盒(深圳邁瑞)；MDA、GSH測定試劑盒(南京建成)；Lyso-Tracker Red、RIPA裂解液(碧云天)；組織蛋白酶B(cathepsin B)活性測定試劑盒(BioVision)；LC3-II抗體(Sigma)；p62抗體、HRP標記抗大鼠IgG抗體、HRP標記抗兔IgG抗體(CST)；溶酶體膜相關(guān)蛋白2A(lysosome associated membrane protein 2A, LAMP2A)抗體(Santa Cruz)；ECL化學(xué)發(fā)光劑(Millipore)。

1.3儀器透射電子顯微鏡TEM(日本日立)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)；電泳儀(美國Bio-Rad)；凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad)。

2 方法

2.1動物模型的建立[7]C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機分為4組，即正常對照組(Con，Lieber De Carli液體飼料)、酒精組(Eth，含乙醇供能30%的Lieber De Carli液體飼料，每1 000 mL飼料中含67.3 mL體積分數(shù)為0.95的乙醇)、酒精+槲皮素組(Eth+Qu，槲皮素100 mg·kg-1)、槲皮素對照組(Qu)。各組小鼠等能量配對喂養(yǎng)15周，記錄每天小鼠的攝食量，并做相應(yīng)的調(diào)整以保證等能量喂養(yǎng)；按照體質(zhì)量確定每只小鼠槲皮素的灌胃量。慢性酒精暴露小鼠模型建立成功后，眼眶取血，迅速剝離肝臟固定于戊二醛或凍存于-80℃冰箱。

2.2肝臟損傷基礎(chǔ)指標檢測用電子顯微鏡觀察肝細胞超微結(jié)構(gòu)的變化；全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST水平；硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定肝臟MDA水平、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)比色法測定肝臟GSH水平。

2.3溶酶體膜透性的檢測Lyso-Tracker Red探針熒光顯微鏡法檢測溶酶體膜透性。小鼠模型建立成功后，每組選取3只，用二步膠原酶法提取原代肝細胞，高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h貼壁后，去除培養(yǎng)基，加入Lyso-Tracker Red探針(100 nmol·L-1)孵育15 min后，用PBS沖洗3遍，熒光顯微鏡觀察紅色熒光強度，拍照，用IPP 6.0圖像處理軟件定量分析紅色熒光強度。

2.4cathepsinB活性檢測蔗糖梯度離心法分離胞質(zhì)及溶酶體，按照cathepsin B活性測定試劑盒操作步驟檢測其活性。

2.5自噬相關(guān)蛋白的檢測Western blot檢測肝臟自噬泡標志物L(fēng)C3-II、自噬底物p62、溶酶體膜相關(guān)蛋白LAMP2A的表達量。稱量100 mg左右肝臟組織，加入1 mL RIPA裂解液提取總蛋白。蛋白濃度用BCA試劑盒測定。利用SDS-PAGE電泳分離蛋白后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用質(zhì)量分數(shù)為0.05的脫脂牛奶進行封閉。根據(jù)抗體說明書進行一抗和經(jīng)HRP標記的二抗孵育。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行拍照和灰度統(tǒng)計。

3 結(jié)果

3.1槲皮素減輕長期酒精暴露引起的肝臟損傷如Fig 1所示，正常對照組小鼠肝臟線粒體結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊。而長期酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟出現(xiàn)了大量的脂滴、線粒體電子密度變大，肝糖原明顯減少。槲皮素的干預(yù)后，小鼠肝臟脂滴明顯減少，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷也明顯改善。血清ALT、AST是反應(yīng)肝損傷的敏感指標，結(jié)果顯示，與對照組相比，長期酒精喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠血清ALT、AST明顯升高，肝細胞損傷明顯，槲皮素干預(yù)減輕了酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟ALT、AST的釋放；丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其水平反映了脂質(zhì)氧化損傷的程度。與對照組相比，長期酒精暴露小鼠肝臟MDA明顯上升，槲皮素干預(yù)后MDA降低了43%。肝臟中GSH含量則反映機體抗氧化水平，長期酒精暴露小鼠肝臟GSH水平明顯降低，抗氧化能力隨之減弱，槲皮素緩解了小鼠肝臟的氧化損傷。槲皮素對正常小鼠肝細胞無明顯影響(Tab 1)。

Tab 1 Effect of quercetin on serum transaminases and liver oxidative damage delivered by chronic alcohol consumption

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsethanol

3.2槲皮素對長期酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟自噬的影響Western blot檢測小鼠肝臟中自噬體標志蛋白LC3-II的含量，如Fig 2A所示，與對照組相比，長期酒精暴露引起小鼠LC3-II明顯升高，LC3-II 的升高可能有兩方面的原因，一是酒精刺激了自噬，二是酒精阻礙了自噬體與溶酶體的融合而抑制自噬。為了進一步分析酒精導(dǎo)致LC3-II蓄積的原因，檢測自噬底物蛋白p62的含量，以衡量自噬流是否順利進行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期酒精喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠肝臟中p62明顯累積，說明酒精損害了自噬體與溶酶體的融合，從而抑制自噬作用(Fig 2B)。槲皮素干預(yù)后，LC3-II及p62的異常累積均得到不同程度的緩解。

Fig 1 Effect of quercetin on liver ultrastructural injury induced by alcohol

Endoplasmic reticulum (black arrowheads indicated), glycogen (hollow arrowheads indicated), mitochondria (black arrows indicated) and lipid droplets (hollow arrows indicated) were observed from transmission electron microscope (TEM) images. Eth: ethanol; Eth+Qu: ethanol plus quercetin; Q: quercetin.

Fig 2 Effect of quercetin on mouse liver autophagy

LC3-Ⅱ and p62 expression was measured by Western blot and quantified by Image J software. GAPDH was used as a protein loading control.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group.

3.3槲皮素對長期酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟溶酶體損傷的保護作用為進一步探討長期酒精抑制自噬的潛在機制，檢測在自噬中發(fā)揮核心作用的溶酶體的損傷，及自噬體與溶酶體融合起關(guān)鍵作用的蛋白LAMP2A的表達情況。結(jié)果顯示，慢性酒精暴露導(dǎo)致小鼠肝臟溶酶體膜明顯損傷，Lyso-Tracker Red染色后，與對照組相比，熒光強度明顯降低(Fig 3A、3B)。溶酶體膜損傷后，cathepsin B釋放到胞質(zhì)中并被激活，如Fig 3C所示，與對照組比較，長期酒精攝入導(dǎo)致胞質(zhì)中cathepsin B的活性明顯升高；槲皮素干預(yù)后，紅色熒光強度明顯回升，同時，cathepsin B的活性也明顯降低；槲皮素本身對溶酶體紅色熒光強度以及cathepsin B活性無明顯影響。LAMP2A被證明是自噬體與溶酶體融合的關(guān)鍵分子，與對照組相比，酒精引起小鼠肝臟LAMP2A表達明顯降低；槲皮素干預(yù)后，LAMP2A表達增加了46%；槲皮素對正常小鼠肝臟LAMP2A的表達無明顯影響(Fig 3D)。

4 討論

肝臟是酒精代謝的主要場所，代謝過程中會引起肝臟一系列的損傷[8]，與以往的研究結(jié)果一致，慢性酒精暴露引起小鼠肝臟出現(xiàn)嚴重的脂肪沉積、線粒體損傷等病變。血清ALT及AST在一定的程度上反映肝細胞損傷，長期酒精攝入引起小鼠血清ALT及AST水平明顯升高。此外，長期酒精喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高，GSH耗竭。

Fig 3 Quercetin ameliorates autophagy impairment induced by chronic alcohol exposure

The hepatocytes were incubated with Lyso-Tracker Red and observed by microscopy. All photos were taken at ×200 (A) and quantified by IPP6.0 (B). C: The cathepsin B activity; D: LAMP2A was measured by Western blot and quantified by Image J software.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsethanol group.

近年來，許多研究表明長期酒精攝入會抑制肝細胞自噬作用，加重肝臟病變[9-10]。本研究中，長期酒精暴露引起小鼠肝臟自噬體標志蛋白LC3-II及自噬底物蛋白p62的含量同時明顯升高。LC3-Ⅱ的升高可能是代表自噬水平的增強，也可能是由于自噬體與溶酶體不能順利融合而導(dǎo)致自噬體累積[11]。大鼠攝入酒精并注射脂多糖后，胰腺LC3-II的明顯增加不是因為自噬作用的增強，而是由于自噬體與溶酶體融合障礙[12]。p62是目前已知最好的自噬特異性底物和評價“自噬流”最有效的標記物，能與LC3結(jié)合并在自噬溶酶體中降解，LC3-II與p62同時增加表明自噬體與溶酶體融合過程受阻，自噬作用抑制[13]。本實驗中，LC3-II與p62異常累積同時發(fā)生，提示長期酒精暴露抑制小鼠肝臟自噬作用。LAMP2A是溶酶體重要的膜蛋白，在自噬體與溶酶體融合中發(fā)揮著主要作用[14]。酒精與內(nèi)毒素引起LAMP2A的嚴重耗竭，導(dǎo)致自噬體與溶酶體融合受阻，從而引起胰腺細胞凋亡甚至壞死[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，長期酒精攝入引起小鼠肝臟溶酶體膜受到了嚴重的損傷，通透性增加，cathepsin B釋放到胞質(zhì)并激活，此外，LAMP2A蛋白水平明顯降低。因而有理由認為溶酶體損傷、LAMP2A的耗竭可能是慢性酒精影響肝臟自噬體與溶酶體融合、引起自噬抑制的重要原因。

槲皮素是食物中最為常見的黃酮類植物化學(xué)物，因其廣泛的生物活性而備受關(guān)注。除了直接的抗氧化作用外，槲皮素還可調(diào)節(jié)多種通路中的關(guān)鍵分子，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在多種疾病模型中亦可通過調(diào)節(jié)自噬而減輕組織損傷[6, 15]。本實驗中，槲皮素干預(yù)緩解了LC3-II及p62的異常積累，增強肝細胞的自噬作用，從而降低了長期酒精攝入引起的小鼠肝臟脂滴沉積及氧化損傷。更重要的是，槲皮素減輕了酒精引起的溶酶體損傷，逆轉(zhuǎn)酒精所致自噬體與溶酶體融合關(guān)鍵蛋白LAMP2A水平的嚴重下降。這是首次在溶酶體水平上探討槲皮素對ALD的保護效應(yīng)。

綜上所述，槲皮素可能通過減輕溶酶體損傷、上調(diào)LAMP2A的表達，促進自噬體與溶酶體的融合，改善慢性酒精暴露所致肝臟自噬抑制，從而減輕酒精性肝損傷，槲皮素調(diào)控LAMP2A表達的潛在機制有待進一步深入探討。

(致謝： C57BL/6J小鼠在華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系動物房飼養(yǎng)，相關(guān)指標測定在深圳市慢性病防治中心理化檢驗科完成，感謝科室領(lǐng)導(dǎo)、同事的關(guān)心與大力幫助。)

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