酸敏感離子通道1a在自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展

陳 勇，葛金芳，陳飛虎

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是退化/上皮鈉通道家族的質(zhì)子門控亞群，是由胞外H+激活的陽(yáng)離子通道，它是由不同亞單位組合成的三聚體蛋白復(fù)合體[1]。到目前為止，已經(jīng)鑒定了由4種基因編碼產(chǎn)生的7種ASICs異構(gòu)體：ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。ASIC1a是ASICs的關(guān)鍵亞基[2]，在中樞外周多種疾病的病理生理過程中的作用被不斷發(fā)現(xiàn)。ASICs的家族成員在很大程度上對(duì)Na+可通透，只有ASIC1a 對(duì)Ca2+可較小程度通透。酸堿平衡是機(jī)體維持正常生理活動(dòng)的必要條件，缺血、缺氧、炎癥引發(fā)的多種疾病都伴有組織酸化特征。ASIC1a 是胞外感受質(zhì)子的關(guān)鍵受體，而酸中毒介導(dǎo)的細(xì)胞損傷與其對(duì)Ca2+的激活密不可分。ASIC1a因其廣泛的生物學(xué)功能與重要的病理學(xué)意義成為近年來研究的熱點(diǎn)，本文就其在自身免疫性疾病中發(fā)生發(fā)展過程中作用的研究進(jìn)展做一綜述。

1 ASIC1a 的基本生物學(xué)特征

1.1ASIC1a的結(jié)構(gòu)ASIC1a是由500多個(gè)氨基酸組成，包含2個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域 (TM1和TM2) 、1個(gè)大的富含半胱氨酸的胞外環(huán)，其N端和C端均在胞內(nèi)，3個(gè)亞基是形成功能性通道所必需的。肽類毒素除了可以驗(yàn)證ASICs在傷害感受和疼痛感覺中的作用之外，還可用于捕捉ASICs在藥理學(xué)、生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)研究的特定構(gòu)象狀態(tài)。德克薩斯州的珊瑚蛇毒素MitTx是一種異二聚體多肽毒素，它以不依賴pH的方式以納摩爾濃度激活A(yù)SIC1a通道，為選擇性ASIC1a強(qiáng)受體激動(dòng)劑。Baconguis等確定了具有最小功能活性的ASIC1a和MitTx的共晶結(jié)構(gòu)，并捕捉到開放狀態(tài)ASIC1a的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，ASIC1a-MitTx復(fù)合物闡明了MitTx的作用機(jī)制：TM2具有不連續(xù)的α螺旋結(jié)構(gòu)，其中Gly-AlaSer采用呈帶狀構(gòu)象延伸的選擇性過濾結(jié)構(gòu)，通過相鄰亞基交換細(xì)胞質(zhì)的1/3的TM2。選擇性過濾器的Gly 443殘基提供3個(gè)羰基氧原子的環(huán)，為水合離子提供了能量屏障[3,7]。

1.2ASIC1a的組織分布ASIC1a是ASICs的關(guān)鍵亞基，廣泛表達(dá)在中樞以及外周神經(jīng)系統(tǒng)。ASIC1a主要分布于中樞的大腦皮質(zhì)、海馬、小腦、松果體、杏仁核、脊髓等部位[4]。Jahr等[5]發(fā)現(xiàn)，在分離的人單核細(xì)胞和分化的破骨細(xì)胞中也有ASIC1a表達(dá)，其在人軟骨細(xì)胞中表達(dá)最為豐富。本課題組前期采用RT-PCR和Western blot研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中存在ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 mRNA及蛋白的表達(dá)，且在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中高表達(dá)，其中ASIC1a表達(dá)水平明顯高于其它亞基[6]。這提示ASIC1a在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)發(fā)生發(fā)展的機(jī)制中可能作為新的靶點(diǎn)起關(guān)鍵性調(diào)控作用，這也為RA的治療提供新的途徑。

1.3ASIC1a的生理學(xué)特性Chu等[7]研究顯示，同聚體ASIC1a通道半數(shù)最大激活pH(pH for half-maximal activation， pH50)介于6.2和6.8之間。當(dāng)培養(yǎng)基中細(xì)胞外pH從7.4迅速下降到較低水平時(shí)，小鼠紋狀體的中等多棘神經(jīng)元(medium spiny neurons, MSNs)觸發(fā)瞬時(shí)內(nèi)向電流。 ASICs活化的劑量-反應(yīng)曲線顯示pH50值為6.25，與同聚體ASIC1a通道的pH50值相當(dāng)。同時(shí)，MSNs中的ASICs電流具有接近+60 mV的反轉(zhuǎn)電位，有線性電流-電壓關(guān)系，表明MSNs中的ASICs是Na+選擇性的。

1.4ASIC1a的通道阻斷劑阿米洛利可以阻斷ENaC Na+/H+交換體和Na+/Ca2+交換體，曾經(jīng)被用作利尿劑，是ASICs的非特異性阻斷劑，其抑制ASIC1a、ASIC1b和ASIC2a電流的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)約為10～20 μmol·L-1，抑制瞬態(tài)ASIC3電流的IC50約為60 μmol·L-1。目前，阿米洛利是用于研究ASICs功能的主要藥理學(xué)工具藥之一。PcTx-1是一種從南美洲狼蛛毒素中純化的多肽，可以通過促進(jìn)ASIC1a的脫敏狀態(tài)，特異性地有效抑制同聚體ASIC1a電流，是ASIC1a相關(guān)科研實(shí)驗(yàn)中常用的工具藥[8]。

2 ASIC1a與自身免疫性疾病

2.1ASIC1a與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎R(shí)A[1,5-6]是一種以慢性、炎癥性、系統(tǒng)性為特征的自身性免疫性疾病，其基本病理改變?yōu)榛ぱ?、關(guān)節(jié)軟骨及其下骨會(huì)被增生滑膜侵蝕，最后演變?yōu)殛P(guān)節(jié)畸形，進(jìn)而導(dǎo)致功能喪失。不確切的病因和尚未闡明的發(fā)病機(jī)制成為RA臨床診斷治療的難題。關(guān)節(jié)軟骨破壞作為其致殘的根本原因，也成為尋找RA發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一。研究表明，ASIC1a在人及大鼠關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)，并在炎癥狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)，提示 RA病程中存在ASIC1a通道的過度激活。目前，對(duì)ASIC1a在RA發(fā)生機(jī)制中作用的研究主要聚焦于細(xì)胞凋亡和自噬機(jī)制。

2.1.1ASIC1a參與調(diào)控RA病程中的細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞程序性死亡，可通過清除機(jī)體衰老或異常的細(xì)胞從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。研究表明，Ca2+可通過作用于線粒體凋亡通路、促進(jìn)細(xì)胞色素C(cytochrome C, cyt-C)的釋放和caspase-3的激活，參與凋亡早期的信號(hào)傳導(dǎo)[9]?，F(xiàn)有研究證實(shí)，RA發(fā)病中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞過度凋亡造成軟骨組織的破壞[10]。那么ASIC1a介導(dǎo)的Ca2+激活是否參與了此過程呢？本課題組研究發(fā)現(xiàn)[11]，在含Ca2+培養(yǎng)基的大鼠軟骨細(xì)胞中，胞外酸化(pH 6.0)時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)，并引起LDH釋放，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞死亡。ASIC1a特異性阻斷劑PcTx-1明顯減少這種[Ca2+]i的增加，并抑制酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷，表明增加[Ca2+]i可能通過ASIC1a介導(dǎo)。進(jìn)一步研究證實(shí)[12]，在小分子干擾RNA介導(dǎo)AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ASIC1a表達(dá)沉默模型中，ASIC1a及其蛋白表達(dá)明顯減少，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡率和凋亡水平明顯降低，同時(shí)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞II型膠原和蛋白聚糖表達(dá)明顯增加，提示沉默ASIC1a能明顯抑制胞外酸化刺激條件下AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞過度凋亡而發(fā)揮保護(hù)作用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，阿米洛利能阻斷ASICs，對(duì)酸誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡有抑制作用，其機(jī)制可能是通過阻斷ASICs抑制Ca2+超載，保護(hù)軟骨細(xì)胞的線粒體功能，調(diào)節(jié)Bcl-2家族凋亡基因的表達(dá)，控制cyt-C的釋放和 caspase凋亡執(zhí)行蛋白的活性來實(shí)現(xiàn)的[10]。因此，阻斷ASIC1a介導(dǎo)的Ca2+超載，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞過度凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，使ASIC1a有望成為RA 關(guān)節(jié)軟骨過度損傷治療的新的潛在靶點(diǎn)。

2.1.2ASIC1a參與調(diào)控RA病程中的細(xì)胞自噬 自噬是一種參與降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶酶體途徑，對(duì)外界各種復(fù)雜條件表現(xiàn)為適應(yīng)機(jī)制，其對(duì)于細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。在過去10年中，許多研究已經(jīng)將自噬與癌癥的起始和進(jìn)展、自身免疫、炎癥、代謝、退行性疾病的進(jìn)展相關(guān)聯(lián)[13]。本課題組[14]相關(guān)研究證實(shí)， ASIC1a參與介導(dǎo)的自噬在RA發(fā)生中起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用：體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在pH 6.0胞外酸化刺激下自噬水平明顯升高，且自噬小體明顯增多，ASIC1a 特異性阻斷劑PcTx-1處理后可明顯抑制自噬水平，且自噬體數(shù)量減少。進(jìn)一步的機(jī)制研究揭示，與pH 6.0組相比，用 ERK1/ 2磷酸化抑制劑處理后，自噬相關(guān)基因 Beclin-1 mRNA和自噬蛋白LC3的表達(dá)均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示胞外酸化環(huán)境可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨自噬的發(fā)生，ASIC1a特異性阻斷劑PcTx-1對(duì)其抑制作用機(jī)制可能與抑制ERK1/2磷酸化有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)[15]，pH 6.0酸化刺激明顯增加軟骨細(xì)胞[Ca2+]i，自噬標(biāo)志物 Beclin-1、ULK1 mRNA 及 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯增高，且酸性自噬溶酶體形成增多，同時(shí)酸化刺激能引起 CaMKKβ及 pAMPK蛋白表達(dá)水平上升，磷酸化蛋白 p-mTOR水平明顯降低。鈣絡(luò)合劑 BAPTA-AM可明顯降低酸化組自噬水平和 CaMKKβ、 p-AMPK表達(dá)下降，p-mTOR表達(dá)明顯升高。但ASIC1a 參與的胞外酸化環(huán)境誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨自噬的發(fā)生機(jī)制是否與其介導(dǎo)的Ca2+激活有關(guān)，仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2ASIC1a與多發(fā)性硬化癥多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性、自身免疫性、神經(jīng)炎性疾病，其特征在于神經(jīng)元脫髓鞘，患者自身免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)大腦、視神經(jīng)、脊髓等神經(jīng)細(xì)胞的髓鞘發(fā)起異常攻擊[16]。脫髓鞘通過軸突阻斷動(dòng)作電位的傳導(dǎo)，破壞突觸前神經(jīng)元的功能，并最終減少突觸后細(xì)胞的活性。這類神經(jīng)組織病變引起的炎癥和組織損傷會(huì)導(dǎo)致一系列的系統(tǒng)癥狀，如肌無力、視覺損害，并最終導(dǎo)致殘疾。盡管近年來有很多研究探討其發(fā)病機(jī)制，但確切病因仍不清楚。電壓門控K+通道阻滯4-氨基吡啶通過抑制神經(jīng)元退化蛋白/上皮Na+通道，用于靶向治療神經(jīng)炎癥疾病多發(fā)性硬化癥，其中主要抑制在中樞神經(jīng)元中表達(dá)的ASIC1a通道。Vergo等[17]通過ASIC1與軸突損傷β-淀粉樣蛋白前體蛋白的共定位發(fā)現(xiàn)，在急性和慢性實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)、MS脊髓和視神經(jīng)組織的炎癥損傷中，ASIC1在小鼠和人類神經(jīng)元軸突中表達(dá)均增強(qiáng)，提示ASIC1的表達(dá)與軸突損傷相關(guān)聯(lián)。Friese等[18]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性病變中ASIC1活化導(dǎo)致軸突變性。在誘導(dǎo)的EAE小鼠模型中，ASIC1-/-與野生型小鼠相比，臨床缺陷和軸突變性均明顯減少。這與酸中毒介導(dǎo)的損傷一致，EAE小鼠脊髓中的pH測(cè)量結(jié)果顯示，組織酸中毒激活A(yù)SIC1。阿米洛利在神經(jīng)外植體和EAE小鼠模型中同樣具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以明顯減少EAE小鼠的軸突變性，保護(hù)髓鞘和神經(jīng)元免受損傷，提示ASIC1阻斷劑可以在多發(fā)性硬化中提供神經(jīng)保護(hù)。Arun等[19]進(jìn)一步臨床研究證實(shí)，在進(jìn)行性多發(fā)性硬化患者的慢性腦損傷中，軸突中ASIC1過表達(dá)與慢性失活損傷中的損傷標(biāo)記物相關(guān)聯(lián)，且阿米洛利對(duì)此有神經(jīng)保護(hù)作用。在對(duì)14名初期進(jìn)行性多發(fā)性硬化患者連續(xù)磁共振成像掃描3年試驗(yàn)顯示，與預(yù)治療期相比，阿米洛利治療期間全腦體積的標(biāo)準(zhǔn)化年率明顯降低，主要臨床相關(guān)白質(zhì)(胼胝體和皮質(zhì)脊髓束)和深層灰質(zhì)(丘腦)結(jié)構(gòu)內(nèi)組織損傷的擴(kuò)散指數(shù)明顯減少。MS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，ASIC1a 在MS患者和動(dòng)物模型上的多種發(fā)現(xiàn)有助于更好地理解其病因及發(fā)病機(jī)制，其抑制劑或?yàn)槠渲委熖峁┬滤悸贰?/p>

2.3ASIC1a與1型糖尿病1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是機(jī)體自身體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)異常，胰島β細(xì)胞選擇性破壞導(dǎo)致胰島素缺乏引起的慢性免疫性疾病[20]。T1DM由于病因復(fù)雜得到研究者普遍關(guān)注，目前研究主要集中于遺傳因素和環(huán)境因素，如病毒感染、毒物等，其他發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)也越來越多。在過去幾年中，ASICs被視為缺血或炎癥相關(guān)過程中的關(guān)鍵感受器。其中，背根神經(jīng)節(jié)中的局部微血管缺血在糖尿病性周圍神經(jīng)病中起重要作用，然而，ASICs在T1DM中的重要意義尚不清楚。近年來，在對(duì)T1DM的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，胰島素能夠維持ASIC1a在細(xì)胞外膜中的低表達(dá)，且 ASIC1a電流動(dòng)力學(xué)似乎受糖尿病狀況的影響最大，電流快于正常血糖條件下的2倍[21]。同時(shí)研究結(jié)果顯示，當(dāng)使用無胰島素培養(yǎng)基時(shí)，胞內(nèi)的ASIC1a大量轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，從而放大ASIC1a通道介導(dǎo)的病理生理效應(yīng)。使用特異性阻斷劑證明ASIC1a通道的不同活性位點(diǎn)受T1DM的影響，PcTx-1能夠降低其對(duì)ASIC1a結(jié)合位點(diǎn)的親和力并增加其失活時(shí)間常數(shù)。炎癥痛模型中的腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子也具有類似的膜轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)，可促進(jìn)ASIC1a從胞內(nèi)到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)[22]。在小鼠T1DM模型中，Radu等[23]進(jìn)一步證明，神經(jīng)元中ASIC1a表達(dá)百分比的增加可能是ASIC1a膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)低胰島素水平響應(yīng)的結(jié)果，PI3K活化導(dǎo)致ASIC1a膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加，其膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可能是胰島素通過PI3K/Akt途徑介導(dǎo)其對(duì)ASIC1a的作用。我們相信，隨著研究的不斷深入，有關(guān)T1DM中ASIC1a膜轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)機(jī)制及其生理病理意義將得到進(jìn)一步的揭示。

2.4ASIC1a與其他自身免疫性疾病吳新安等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在硝普鈉誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡體外模型中，阿米洛利可明顯降低大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率，同時(shí)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯減少，但其是否通過阻斷ASICs發(fā)揮關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用，仍有待進(jìn)一步證實(shí)。也有研究發(fā)現(xiàn)，ASIC1a在終止癲癇發(fā)作中具有關(guān)鍵作用。眾所周知，癲癇發(fā)作和神經(jīng)元過度興奮誘導(dǎo)腦中pH水平的降低，在小鼠中干擾ASIC1a基因可增強(qiáng)癲癇發(fā)作的嚴(yán)重性，而ASIC1a基因的過表達(dá)則顯示相反的效果。酸中毒誘導(dǎo)的ASIC1a激活通過促進(jìn)抑制性中間神經(jīng)元的功能來終止癲癇發(fā)作[25]。因此，ASIC1a激活劑可作為治療癲癇發(fā)作的靶標(biāo)。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

自身免疫疾病是機(jī)體在應(yīng)對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)導(dǎo)致自身組織損傷所引起的疾病，過度活化的T、B細(xì)胞和隨之伴隨的慢性炎癥反應(yīng)引起機(jī)體多組織器官受損。然而，其病因和發(fā)病機(jī)制又較為復(fù)雜，可能與免疫耐受、遺傳因素、病毒入侵機(jī)體造成損害等多種因素有關(guān)，對(duì)其確切診斷和治療造成很大難題。ASIC1a作為細(xì)胞外質(zhì)子的關(guān)鍵受體，參與涉及組織酸中毒的多種病理生理過程，其在自身免疫性疾病如RA、MS、T1DM等中的廣泛而重要的生理病理學(xué)作用得到越來越多的研究者普遍關(guān)注。本課題組在RA動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中對(duì)ASIC1a參與的關(guān)節(jié)軟骨損傷中的機(jī)制做了較為深入的研究，試圖為RA發(fā)病機(jī)制及軟骨損傷修復(fù)提供新的理解思路。同時(shí)，越來越多的ASICs抑制劑不斷被研制出，但其選擇性抑制劑和能推向臨床應(yīng)用的抑制劑仍有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)研制，以ASIC1a作為靶點(diǎn)將為自身免疫性疾病的治療提供新的方向。目前，ASIC1a在自身免疫性疾病中的研究仍處于起始階段，ASIC1a與自身免疫性疾病之間的聯(lián)系需要進(jìn)一步的揭示，其確切的臨床意義及應(yīng)用前景仍有待進(jìn)一步的研究和探索。

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