烏司他丁對(duì)水下爆炸繼發(fā)性急性肺損傷兔基質(zhì)金屬蛋白酶-9等的影響

王前進(jìn)，黃奕江，葉長(zhǎng)青，邵先安，徐長(zhǎng)江，丁體龍，馬宏昊，郝 建，齊曉林

爆炸性武器在水下爆炸時(shí)均能造成水下沖擊傷，文獻(xiàn)報(bào)道第二次世界大戰(zhàn)中曾發(fā)生數(shù)千例水下沖擊傷傷員,且傷情重,救治難度大,病死率高[1]?，F(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)中，水下沖擊傷仍是海戰(zhàn)和島礁登陸作戰(zhàn)時(shí)最常見的損傷。肺是水下沖擊波致傷和致死的靶器官，急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是早期死亡的主要原因，在水下沖擊傷早期救治中，重點(diǎn)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)肺損傷的救治[2]。研究表明，炎癥介質(zhì)在繼發(fā)性肺損傷中發(fā)揮重要作用[3]。烏司他丁是一種蛋白酶抑制劑，可有效調(diào)節(jié)炎癥遞質(zhì)水平，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而起到保護(hù)肺功能的作用。本試驗(yàn)建立兔水下爆炸肺損傷動(dòng)物模型，研究烏司他丁對(duì)繼發(fā)性急性肺損傷兔MMP-9等細(xì)胞因子水平影響，探討其治療作用及機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

健康新西蘭兔30只，雌雄不限，質(zhì)量(2.15±0.26)kg，購(gòu)自安徽長(zhǎng)臨河醫(yī)藥科技有限公司[許可證號(hào)syxk(皖)2007-002]，實(shí)驗(yàn)兔均按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。烏司他丁注射液(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)；MMP-9試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：201602)；NE試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：201602)；TNF-α試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：201602)；蛋白提取和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京信諾金生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，western blot kit(Shanghai BBI Life Sciences，批號(hào)：C600392)，MMP-9抗體(STANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,USA，批號(hào)：SC-21733)，GAPDH抗體(STANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,USA，批號(hào)：SC-66163)，Blue Plus II Protein Marker(14～120kDa)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；血?dú)夥治霾捎妹腊麪朎poc?血?dú)夥治鱿到y(tǒng)。

2 爆炸裝置

爆炸源為太安炸藥，壓力數(shù)據(jù)測(cè)試系統(tǒng)包括安捷倫示波器(型號(hào)dso5054A)，水下壓力傳感器為pcb138A25(由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)近代力學(xué)系爆炸實(shí)驗(yàn)室提供)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1實(shí)驗(yàn)分組 將30只新西蘭兔隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(N組)、爆炸組(I組)和爆炸后烏司他丁治療組(B組)，每組10只。造模完成后，B組經(jīng)右頸外靜脈注射烏司他丁注射液(10萬(wàn)單位/kg)，N組、I組注射等量生理鹽水。

3.2模型建立 氯胺酮40mg/kg、氟哌利多1.6mg/kg經(jīng)肌肉注射麻醉實(shí)驗(yàn)兔[4]，兔胸部及頸部備皮，分別經(jīng)左頸總動(dòng)脈和右頸外靜脈放置留置針。新西蘭兔固定在自制鋼質(zhì)保護(hù)箱中，保護(hù)箱在兔胸部處開一窗口，窗口大小與兔子胸部一致，且可調(diào)節(jié)。頭部露出水面，其余部位如腹部、四肢等均保護(hù)在箱體內(nèi)，將兔保護(hù)箱放置于水下爆炸罐內(nèi)并固定。爆源采用太安炸藥1g，制成圓柱狀藥包，炸藥采用導(dǎo)爆管起爆，同時(shí)保證新西蘭兔胸部中心與水下壓力傳感器位于同一水平線上。爆炸實(shí)驗(yàn)操作全部由專業(yè)人員實(shí)施[5]。

3.3標(biāo)本采集 各組經(jīng)留置的動(dòng)脈針分別采集傷后12、24h的動(dòng)脈血，行血?dú)夥治?，同時(shí)采集部分動(dòng)脈血離心，分離血清備用。傷后24h放血處死實(shí)驗(yàn)兔。夾閉左主支氣管，0.9%氯化鈉10mL經(jīng)氣管反復(fù)3次灌洗右肺，抽取支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心備用。取左肺下葉，吸干表面雜質(zhì)，測(cè)干濕比重。左肺上葉下部經(jīng)0.9%氯化鈉沖洗，10%甲醛固定。其余左上肺葉做勻漿。

4 觀察指標(biāo)

4.1MMP-9濃度測(cè)定 動(dòng)脈血離心取血清，ELISA測(cè)定濃度，試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

4.2Western blot法測(cè)定MMP-9表達(dá)水平 取肺組織50mg，加入800μL RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，13 000rpm離心30min，將上清液轉(zhuǎn)入新管中即為總蛋白。經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育等步驟后，得到蛋白條帶；實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

4.3RT-PCR法測(cè)定MMP-9 采用TRIzol法提取各組肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cRNA并進(jìn)行熒光定量PCR。選定 GAPDH為內(nèi)參基,根據(jù)擴(kuò)增曲線確定Ct值，熒光定量采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)相對(duì)值。引物序列如下：MMP-9上游引物：5′-ACACACGACGTCTTCCA-3′,MMP-9下游引物：5′-GAGCTTTGACATCCTGCA-3′,MMP-9探針：5′FAM-CTACTTCTGCCAGGACCGCTTCTTCTG-TAMRA3′，GAPDH上游引物：5′-GCCATCACTGCCACCCA-3′，GAPDH下游引物：5′-CAGTGAGCTTCCCGTTC-3′，GAPDH探針：5′FAM-CCGCCCAGAACATCATCCCTG-TAMRA3′。

4.4BALF中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)含量測(cè)定 回收BALF約6mL，3000r/min離心10min(室溫)，取上清液存于-80℃冰箱。按照ELISA說明書測(cè)定。

4.5TNF-α濃度測(cè)定 動(dòng)脈血離心取血清，ELISA測(cè)定濃度，試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

4.6肺病理組織學(xué)觀察 左肺上葉下部經(jīng)0.9%氯化鈉沖洗，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片4～5μm厚，HE染色，光鏡下由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生分別獨(dú)立觀察。

4.7濕干比(W/D) 取左肺下葉，吸干表面雜質(zhì)，天平稱取肺濕重后，置于80℃烘箱烘72h至烘干，稱取干重，計(jì)算W/D。

4.8動(dòng)脈血?dú)夥治?經(jīng)左頸總動(dòng)脈留置管采動(dòng)脈血2mL，即刻行血?dú)夥治觥?/p>

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 血清和肺組織MMP-9的含量比較

I組12、24h血清MMP-9含量均較N組升高(P<0.05)，B組的12、24h血清MMP-9含量均較I組降低(P<0.05)；I組肺組織MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較N組升高(P<0.05)，B組肺組織MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較I組降低(P<0.05)。見表1。

表1 血清和肺組織MMP-9的含量比較(n=10)

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與爆炸組比較：#P<0.05

2 Western blot法測(cè)定各組MMP-9表達(dá)水平

I組MMP-9蛋白表達(dá)最明顯，B組的MMP-9蛋白表達(dá)較I組降低。見圖1。

圖1 Western blot法測(cè)定各組MMP-9表達(dá)水平

3 肺W/D、BALF中NE含量比較

I組W/D、BALF中NE含量均較N組升高(P<0.05)，B組的W/D、BALF中NE含量較I組降低(P<0.05)。見表2。

表2 肺W/D、BALF中NE含量比較(n=10)

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與爆炸組比較：#P<0.05

4 血清TNF-α和動(dòng)脈PaO2比較

I組12h、24h血清TNF-α含量均較N組升高(P<0.05)，B組的12、24h血清TNF-α含量均較I組降低(P<0.05)；I組24h PaO2較N組降低(P<0.05)，B組24h PaO2較I組升高(P<0.05)。見表3。

5 肺組織HE染色

N組肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯損傷，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯水腫及炎癥等改變(圖2)；I組肺組織結(jié)構(gòu)損傷明顯，肺泡壁斷裂破碎，肺間質(zhì)及肺泡腔水腫、出血，大量多形核粒細(xì)胞(PMN)浸潤(rùn)，間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)血流淤滯(圖3)，提示ALI模型復(fù)制成功；B組肺組織出血滲出及間質(zhì)增寬程度較I組明顯減輕(圖4)。

表3 血清TNF-α和動(dòng)脈PaO2比較

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與爆炸組比較：#P<0.05

圖2 N組肺組織(HE ×100)圖3 I組肺組織(HE ×100)圖4 B組肺組織(HE ×100)

討 論

水下爆炸產(chǎn)生沖擊波，直接作用于胸部，對(duì)肺造成原發(fā)性損傷。大量多形核粒細(xì)胞(PMN)在肺部聚集，激活并釋放NE、MMP-9等多種炎癥介質(zhì)，引起繼發(fā)性損傷，不及時(shí)救治，易導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征[6]，早期病死率極高[7]。

水下沖擊波直接損傷肺組織，肺泡巨噬細(xì)胞被激活并釋放多種炎性因子，如TNF-α、白細(xì)胞介素等，這些細(xì)胞因子介導(dǎo)PMN聚集，黏附在肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，激活并脫顆粒，釋放NE、MMP-9等多種炎癥介質(zhì)。有研究認(rèn)為，在激活的中性粒細(xì)胞釋放的各種組織損傷因子中，血漿蛋白酶如NE、MMP-9被認(rèn)為與急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征密切相關(guān)[8-9]。急性肺損傷的早期階段，在肺組織、BALF中均可檢測(cè)到高濃度的MMP(主要是MMP-9)[10]。NE能夠分解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和許多重要血漿蛋白，造成彈力纖維和膠原纖維斷裂、分離，肺泡擴(kuò)張；MMP-9直接作用于肺泡毛細(xì)血管基膜,使其通透性增加，直接參與肺損傷過程中的細(xì)胞外基質(zhì)的分解和重塑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，爆炸組12h TNF-α明顯升高，24h仍高于對(duì)照組，BALF中NE也明顯升高，血清12、24h MMP-9均高于對(duì)照組，肺組織MMP-9蛋白和mRNA的表達(dá)水平也明顯升高。光鏡下肺泡間隔明顯增寬，PMN聚集，肺泡壁斷裂斷裂，可見肺大泡形成。肺W/D較對(duì)照組升高，說明肺水腫嚴(yán)重。24h動(dòng)脈PaO2較對(duì)照組升高，提示呼吸功能受損。以上均說明細(xì)胞因子在水下爆炸繼發(fā)性肺損傷中發(fā)揮重要作用，MMP-9可以作為炎癥的早期檢測(cè)指標(biāo)，可預(yù)示炎癥的發(fā)生[11]。

多種炎癥因子介導(dǎo)的肺部失控性炎癥反應(yīng)是ALI主要病理生理基礎(chǔ)，有效控制和減輕肺部過度炎癥反應(yīng)是治療關(guān)鍵[12]。烏司他丁系從健康成年男性尿液中分離純化而得的一種糖蛋白，屬于Kunitz型蛋白酶抑制劑的一種，能夠抑制多種蛋白、糖和脂類水解酶的活性，具有抑制炎癥介質(zhì)釋放、抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、清除自基、穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶釋放的作用，對(duì)肺損傷起保護(hù)作用。TNF-α是最主要也是最初啟動(dòng)炎性反應(yīng)的炎性細(xì)胞因子，能激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)炎性介質(zhì)合成，導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控。烏司他丁通過抑制TNF-α的過度生成，控制炎癥反應(yīng)程度，進(jìn)而抑制中性粒細(xì)胞的活化，阻抑炎癥反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)肺功能的目的[13]。有研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁通過抑制肺組織中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)的過度釋放，有效保護(hù)油酸所致的大鼠 ALI，顯著改善血氧飽和度[14]。本實(shí)驗(yàn)靜脈注射烏司他丁12h，血清TNF-α即明顯降低，24h BALF中NE、血清和肺組織中MMP-9較爆炸組降低，病理檢查證實(shí)應(yīng)用烏司他丁后肺組織出血滲出及間質(zhì)增寬程度明顯減輕，PMN減少，血?dú)夥治鎏崾?4h動(dòng)脈PaO2升高，肺W/D明顯降低。說明靜滴烏司他丁后，急性肺損傷明顯好轉(zhuǎn)，治療有效。分析其作用機(jī)制可能為： 烏司他丁抑制TNF-α產(chǎn)生，阻止PMN在肺內(nèi)集聚、粘附，減少NE、MMP-9等炎癥介質(zhì)釋放； 烏司他丁水解NE，降低活性，減輕NE觸發(fā)的“瀑布樣級(jí)聯(lián)釋放”；烏司他丁抑制MMP-9在血清和肺組織的表達(dá)，減輕對(duì)肺的損傷。

綜上所述，NE、MMP-9可以作為水下爆炸ALI指標(biāo)，但BALF需行支氣管鏡檢查才能獲取，BALF中NE不能作為常規(guī)檢測(cè)。MMP-9可以作為炎癥的早期檢測(cè)指標(biāo)，在ALI發(fā)生中起重要重要，血清ELISA檢測(cè)方便易行，能反映水下爆炸ALI程度及治療效果。烏司他丁通過抑制NE、MMP-9表達(dá)，改善肺毛細(xì)血管通透性、減少滲出，減輕水下爆炸致家兔 ALI的程度，可有效治療ALI。

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