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    乳腺浸潤性導(dǎo)管癌TOP2A基因狀態(tài)與HER2及臨床病理特征的關(guān)系

    2018-01-18 21:40:48趙麗輝易冰孟鳳嬌
    關(guān)鍵詞:蒽環(huán)類浸潤性乳腺

    趙麗輝,易冰,孟鳳嬌

    (中山市人民醫(yī)院1.分子診斷中心,2.病理科,廣東 中山528403)

    乳腺癌發(fā)病率以每年5%的速度增長,且呈年輕化、低齡化[1-3]。目前乳腺癌的治療除手術(shù)外,還包括激素治療、化療和靶向治療;蒽環(huán)類藥物在化療方案中具有重要作用,但有效率僅為25% ~30%[4-5]。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(topoisomeraseⅡalpha,TOP2A)是常見的化療療效預(yù)測(cè)因子,其擴(kuò)增或缺失與蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)性之間具有相關(guān)性[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)[8],蒽環(huán)類藥物作用于TOP2a蛋白,產(chǎn)生細(xì)胞毒作用,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但同時(shí)具有嚴(yán)重的毒副作用。人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)基因,也是臨床預(yù)后重要的指標(biāo)之一,其與TOP2A在乳腺癌中的表達(dá)具有一定相關(guān)性[9]。有分析指出,TOP2A基因擴(kuò)增時(shí)不伴HER2基因擴(kuò)增極為罕見。研究表明,當(dāng)不存在HER2/neu型基因時(shí),很大一部分乳腺癌患者會(huì)出現(xiàn)TOP2A基因擴(kuò)增或過表達(dá)[10-11]。因此,本文擬通過熒光原位雜交法(FISH)檢測(cè)371例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者TOP2A基因,分析其基因狀態(tài)與HER2基因、HER2蛋白表達(dá)及臨床病理特征之間的相關(guān)性。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 研究對(duì)象

    篩選收集2015年7月至2017年5月于中山市人民醫(yī)院乳腺外科就診的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者371例。其中,男3例,女368例;年齡25~86歲,≥50歲191例,<50歲180例;乳腺手術(shù)切除116例,B超引導(dǎo)下乳腺腫塊穿刺活檢255例;左乳190例,右乳181例。

    所有患者手術(shù)及穿刺前均未行放療、化療或分子靶向治療。手術(shù)及穿刺標(biāo)本均按常規(guī)行10%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片及HE染色,由病理科醫(yī)師閱片確診為浸潤性導(dǎo)管癌。本研究所涉及的相關(guān)病理檢測(cè)均獲得患者的知情同意。

    1.2 試劑與儀器

    FISH檢測(cè)GLP TOP2A/GSP 17探針試劑盒購自廣州安必平生物技術(shù)有限公司;ThermoBrite S500-24熒光原位雜交儀(美國Abbott公司);BX51熒光顯微鏡,JENOPTIK攝像頭及FISH分析軟件(日本Olympus公司)。雙色銀染原位雜交法(DISH)檢測(cè)試劑包括Inform HER-2/CEP17 DNA雙探針、Ultra-View SISH DNP檢測(cè)試劑盒、UltraViewRed ISH DIG檢測(cè)試劑盒以及輔助試劑均為瑞士羅氏Ventana公司產(chǎn)品;免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)試劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司;BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀(瑞士羅氏Ventana公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 FISH檢測(cè)TOP2A基因狀態(tài) 3~4μm連續(xù)石蠟切片,貼至涂膠片上,65℃恒溫箱烤片過夜;二甲苯脫蠟2次,每次15 min;無水乙醇脫蠟10 min;梯度乙醇(100%、95%、80%、70%)脫水各 3 min至去離子水;100℃煮片25 min;晾干后胃蛋白酶37℃恒溫消化3~10 min;2×SSC緩沖液洗片2次,每次5 min;梯度乙醇(70%、80%、95%、100%)脫水各3 min,自然晾干;滴加TOP2A雜交液,封片,在雜交儀上變性雜交10~18 h,2×SSC與0.1%NP-40洗液洗去多余雜交液;滴加DAPI復(fù)染劑于熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。檢測(cè)前需通過HE染色切片定位腫瘤浸潤區(qū)域。

    1.3.2 DISH檢測(cè)HER2基因狀態(tài) 3~4μm石蠟切片,65℃恒溫箱烤片1~2 h,置于BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色機(jī),放入DISH檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè),具體按操作試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)束后取片,用含清潔劑的清水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。以腫瘤周邊的間質(zhì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其他非腫瘤細(xì)胞作為自身內(nèi)對(duì)照。

    1.3.3 IHC檢測(cè) HER2蛋白表達(dá) 2~3μm石蠟切片,65℃恒溫箱烤片1~2 h,將切片置于Bench-Mark XT全自動(dòng)免疫組化染色機(jī),放入DAB試劑盒、蘇木素、返藍(lán)液,一抗為 HER2/NEU(4B5)單克隆抗體,具體操作步驟嚴(yán)格按羅氏診斷優(yōu)化程序執(zhí)行。結(jié)束后取片,用含清潔劑的清水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。陰性對(duì)照為同一切片中正常導(dǎo)管上皮,陽性對(duì)照選取HER2(2+)并經(jīng)FISH檢測(cè)證實(shí)的乳腺癌病例。

    1.3.4 結(jié)果判讀 FISH結(jié)果判讀的具體方法參照文獻(xiàn)[12-13];DISH檢測(cè)結(jié)果判讀參照2013年ASCO/CAPHER2指南[13];IHC:參照乳腺癌 HER2檢測(cè)指南(2014版),均以浸潤癌細(xì)胞為觀察目標(biāo),無著色或≤10%癌細(xì)胞微弱膜著色為(0);≥10%癌細(xì)胞微弱膜著色為(1+);10%癌細(xì)胞不完整和(或)中等強(qiáng)度膜著色,或≤10%癌細(xì)胞強(qiáng)而完整的膜著色為(2+);>10%癌細(xì)胞強(qiáng)而完整的膜著色為(3+)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各變量之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 TOP2A基因狀態(tài)與HER2的相關(guān)性

    由表1可見,371例患者中TOP2A基因擴(kuò)增64例,缺失 12例,總異常率為 20.49%(76/371),無擴(kuò)增或缺失295例;HER2基因擴(kuò)增122例(32.88%,122/371),高于TOP2A基因擴(kuò)增;TOP2A基因與HER2基因共擴(kuò)增53例;12例TOP2A基因缺失中有9例HER2基因擴(kuò)增,295例TOP2A基因無擴(kuò)增或缺失中有60例HER2基因擴(kuò)增。統(tǒng)計(jì)分析顯示,TOP2A基因狀態(tài)與HER2基因明顯相關(guān)(P<0.05)。TOP2A基因擴(kuò)增率隨HER2蛋白表達(dá)增強(qiáng)而增高(P<0.05),TOP2A基因狀態(tài)與HER2蛋白表達(dá)明顯相關(guān)(P<0.05)。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌基因TOP2A和HER2基因狀態(tài)及 HER2蛋白表達(dá)見圖1。

    表1 TOP2A基因與HER2基因及HER2蛋白表達(dá)的關(guān)系 例(%)

    圖1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌基因狀態(tài)及蛋白表達(dá)

    2.2 TOP2A基因異常與臨床病理特征的關(guān)系

    由表2可見,TOP2A基因狀態(tài)與年齡、部位及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P>0.05);男性異常率高于女性,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);Ⅰ級(jí)異常率最低(3.03%),Ⅲ級(jí)異常率最高(30.91%),TOP2A基因狀態(tài)與病理組織學(xué)分級(jí)相關(guān)(P<0.05);TOP2A基因異常中伴有高級(jí)別導(dǎo)管原位癌的病例高于伴中、低級(jí)別導(dǎo)管原位癌的病例,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);腫瘤直徑為 2~5 cm時(shí)TOP2A基因擴(kuò)增和缺失率較高,腫瘤直徑與TOP2A基因狀態(tài)相關(guān)(P<0.05)。

    3 討論

    TOP2A基因是核基質(zhì)成分之一,在核內(nèi)發(fā)揮作用[14]。TOP2A作為調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化、控制核酸生理功能的關(guān)鍵酶,在多種細(xì)胞中均有表達(dá),且在增殖細(xì)胞中呈周期性特異表達(dá)。TOP2A在腫瘤細(xì)胞的不同周期表達(dá)各異,一般表現(xiàn)為在DNA復(fù)制后期及有絲分裂期表達(dá)增加,有絲分裂期結(jié)束后表達(dá)有所下降,提示腫瘤增殖受TOP2A表達(dá)影響[15]。TOP2A基因參與乳腺癌細(xì)胞的復(fù)制,存在TOP2A基因異常的患者預(yù)后差,無復(fù)發(fā)生存期縮短,尤其是TOP2A基因缺失的患者預(yù)后更差。基因擴(kuò)增提示腫瘤有復(fù)發(fā)的可能,或者遠(yuǎn)期的療效下降。因此,正確檢測(cè)和評(píng)定乳腺癌中TOP2A狀態(tài)至關(guān)重要。

    表2 TOP2A基因與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

    TOP2A變異有兩種表現(xiàn)形式,分別是TOP2A基因拷貝數(shù)(判斷擴(kuò)增與否)和TOP2AmRNA表達(dá)。國外有文獻(xiàn)報(bào)道,乳腺癌TOP2A基因擴(kuò)增率為23.9%,基因缺失率為2.8%[16];國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道TOP2A基因擴(kuò)增率為12.6%~19.0%,未見有缺失報(bào)道[17-19]。本研究顯示,371例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者TOP2A基因異常率為20.49%,其中擴(kuò)增率為17.25%(64/371),與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符。TOP2A基因和HER2原癌基因均定位于染色體17q11.2-22,且二者相近。有研究表明[9],HER2與 TOP2A在乳腺癌中的表達(dá)存在一定相關(guān)性且共同影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展。明潔等[18]研究顯示,TOP2A擴(kuò)增及表達(dá)可能依賴于 HER2擴(kuò)增及表達(dá);TOP2A與HER2呈共表達(dá)[20],HER2蛋白過表達(dá)與基因擴(kuò)增存在一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示,HER2基因擴(kuò)增(122例)高于 TOP2A基因擴(kuò)增(64例),TOP2A與HER2基因共擴(kuò)增53例,達(dá)82.81%,二者呈明顯相關(guān),說明HER2基因表達(dá)可影響TOP2A基因表達(dá)。122例HER2基因擴(kuò)增中有60例TOP2A基因無擴(kuò)增或缺失,249例HER2無擴(kuò)增中有10例TOP2A基因擴(kuò)增,76例TOP2A基因擴(kuò)增和缺失中有13例HER2基因并無擴(kuò)增,這說明TOP2A與HER2基因雖具有相關(guān)性,但仍有各自獨(dú)立的因素存在。本研究中TOP2A基因擴(kuò)增隨HER2蛋白表達(dá)增強(qiáng)而增高,TOP2A基因缺失在HER2蛋白表達(dá)為3+時(shí)最高,說明HER2蛋白過表達(dá)不但與HER2基因擴(kuò)增相關(guān),與TOP2A基因異常也存在一定的相關(guān)性。此外我們發(fā)現(xiàn),TOP2A基因改變與患者年齡、性別和部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性,男性乳腺癌異常率雖然高于女性,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是由于樣本例數(shù)較少,還有待于積累病例數(shù)進(jìn)一步明確。浸潤性導(dǎo)管癌組織學(xué)分級(jí)越高,腫瘤細(xì)胞分化程度越差,TOP2A基因異常率就越高,而且腫瘤直徑為2~5 cm時(shí)TOP2A基因擴(kuò)增和缺失率較高。此外,76例TOP2A基因異常的浸潤性導(dǎo)管癌中有16例伴有不同分化程度的原位癌,以高級(jí)別原位癌為主,這可能是腫瘤在從原位癌發(fā)展為浸潤癌的過程中細(xì)胞增殖比較活躍導(dǎo)致異常率增高的原因。

    TOP2A是蒽環(huán)類抗生素的靶酶,TOP2A基因擴(kuò)增或缺失可影響蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)及藥效[21-22],而HER2狀態(tài)對(duì)預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物的化療效果尚無定論。有研究報(bào)道[19],TOP2A可能比HER2對(duì)蒽環(huán)類藥物更有預(yù)測(cè)作用。因此,臨床在使用蒽環(huán)類藥物治療時(shí),應(yīng)分別進(jìn)行TOP2A及HER2基因檢測(cè),尤其是對(duì)HER2蛋白高表達(dá)、腫瘤組織分級(jí)高的患者。

    乳腺浸潤性導(dǎo)管癌TOP2A基因、HER2基因及蛋白的表達(dá)存在復(fù)雜性,但已成為乳腺癌治療和預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo),TOP2A基因檢測(cè)可能是乳腺浸潤性導(dǎo)管癌蒽環(huán)類藥物使用的重要依據(jù)。

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