• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乳腺浸潤性導(dǎo)管癌TOP2A基因狀態(tài)與HER2及臨床病理特征的關(guān)系

    2018-01-18 21:40:48趙麗輝易冰孟鳳嬌
    關(guān)鍵詞:蒽環(huán)類浸潤性乳腺

    趙麗輝,易冰,孟鳳嬌

    (中山市人民醫(yī)院1.分子診斷中心,2.病理科,廣東 中山528403)

    乳腺癌發(fā)病率以每年5%的速度增長,且呈年輕化、低齡化[1-3]。目前乳腺癌的治療除手術(shù)外,還包括激素治療、化療和靶向治療;蒽環(huán)類藥物在化療方案中具有重要作用,但有效率僅為25% ~30%[4-5]。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(topoisomeraseⅡalpha,TOP2A)是常見的化療療效預(yù)測(cè)因子,其擴(kuò)增或缺失與蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)性之間具有相關(guān)性[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)[8],蒽環(huán)類藥物作用于TOP2a蛋白,產(chǎn)生細(xì)胞毒作用,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但同時(shí)具有嚴(yán)重的毒副作用。人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)基因,也是臨床預(yù)后重要的指標(biāo)之一,其與TOP2A在乳腺癌中的表達(dá)具有一定相關(guān)性[9]。有分析指出,TOP2A基因擴(kuò)增時(shí)不伴HER2基因擴(kuò)增極為罕見。研究表明,當(dāng)不存在HER2/neu型基因時(shí),很大一部分乳腺癌患者會(huì)出現(xiàn)TOP2A基因擴(kuò)增或過表達(dá)[10-11]。因此,本文擬通過熒光原位雜交法(FISH)檢測(cè)371例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者TOP2A基因,分析其基因狀態(tài)與HER2基因、HER2蛋白表達(dá)及臨床病理特征之間的相關(guān)性。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 研究對(duì)象

    篩選收集2015年7月至2017年5月于中山市人民醫(yī)院乳腺外科就診的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者371例。其中,男3例,女368例;年齡25~86歲,≥50歲191例,<50歲180例;乳腺手術(shù)切除116例,B超引導(dǎo)下乳腺腫塊穿刺活檢255例;左乳190例,右乳181例。

    所有患者手術(shù)及穿刺前均未行放療、化療或分子靶向治療。手術(shù)及穿刺標(biāo)本均按常規(guī)行10%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片及HE染色,由病理科醫(yī)師閱片確診為浸潤性導(dǎo)管癌。本研究所涉及的相關(guān)病理檢測(cè)均獲得患者的知情同意。

    1.2 試劑與儀器

    FISH檢測(cè)GLP TOP2A/GSP 17探針試劑盒購自廣州安必平生物技術(shù)有限公司;ThermoBrite S500-24熒光原位雜交儀(美國Abbott公司);BX51熒光顯微鏡,JENOPTIK攝像頭及FISH分析軟件(日本Olympus公司)。雙色銀染原位雜交法(DISH)檢測(cè)試劑包括Inform HER-2/CEP17 DNA雙探針、Ultra-View SISH DNP檢測(cè)試劑盒、UltraViewRed ISH DIG檢測(cè)試劑盒以及輔助試劑均為瑞士羅氏Ventana公司產(chǎn)品;免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)試劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司;BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀(瑞士羅氏Ventana公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 FISH檢測(cè)TOP2A基因狀態(tài) 3~4μm連續(xù)石蠟切片,貼至涂膠片上,65℃恒溫箱烤片過夜;二甲苯脫蠟2次,每次15 min;無水乙醇脫蠟10 min;梯度乙醇(100%、95%、80%、70%)脫水各 3 min至去離子水;100℃煮片25 min;晾干后胃蛋白酶37℃恒溫消化3~10 min;2×SSC緩沖液洗片2次,每次5 min;梯度乙醇(70%、80%、95%、100%)脫水各3 min,自然晾干;滴加TOP2A雜交液,封片,在雜交儀上變性雜交10~18 h,2×SSC與0.1%NP-40洗液洗去多余雜交液;滴加DAPI復(fù)染劑于熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。檢測(cè)前需通過HE染色切片定位腫瘤浸潤區(qū)域。

    1.3.2 DISH檢測(cè)HER2基因狀態(tài) 3~4μm石蠟切片,65℃恒溫箱烤片1~2 h,置于BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化染色機(jī),放入DISH檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè),具體按操作試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)束后取片,用含清潔劑的清水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。以腫瘤周邊的間質(zhì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其他非腫瘤細(xì)胞作為自身內(nèi)對(duì)照。

    1.3.3 IHC檢測(cè) HER2蛋白表達(dá) 2~3μm石蠟切片,65℃恒溫箱烤片1~2 h,將切片置于Bench-Mark XT全自動(dòng)免疫組化染色機(jī),放入DAB試劑盒、蘇木素、返藍(lán)液,一抗為 HER2/NEU(4B5)單克隆抗體,具體操作步驟嚴(yán)格按羅氏診斷優(yōu)化程序執(zhí)行。結(jié)束后取片,用含清潔劑的清水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。陰性對(duì)照為同一切片中正常導(dǎo)管上皮,陽性對(duì)照選取HER2(2+)并經(jīng)FISH檢測(cè)證實(shí)的乳腺癌病例。

    1.3.4 結(jié)果判讀 FISH結(jié)果判讀的具體方法參照文獻(xiàn)[12-13];DISH檢測(cè)結(jié)果判讀參照2013年ASCO/CAPHER2指南[13];IHC:參照乳腺癌 HER2檢測(cè)指南(2014版),均以浸潤癌細(xì)胞為觀察目標(biāo),無著色或≤10%癌細(xì)胞微弱膜著色為(0);≥10%癌細(xì)胞微弱膜著色為(1+);10%癌細(xì)胞不完整和(或)中等強(qiáng)度膜著色,或≤10%癌細(xì)胞強(qiáng)而完整的膜著色為(2+);>10%癌細(xì)胞強(qiáng)而完整的膜著色為(3+)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各變量之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 TOP2A基因狀態(tài)與HER2的相關(guān)性

    由表1可見,371例患者中TOP2A基因擴(kuò)增64例,缺失 12例,總異常率為 20.49%(76/371),無擴(kuò)增或缺失295例;HER2基因擴(kuò)增122例(32.88%,122/371),高于TOP2A基因擴(kuò)增;TOP2A基因與HER2基因共擴(kuò)增53例;12例TOP2A基因缺失中有9例HER2基因擴(kuò)增,295例TOP2A基因無擴(kuò)增或缺失中有60例HER2基因擴(kuò)增。統(tǒng)計(jì)分析顯示,TOP2A基因狀態(tài)與HER2基因明顯相關(guān)(P<0.05)。TOP2A基因擴(kuò)增率隨HER2蛋白表達(dá)增強(qiáng)而增高(P<0.05),TOP2A基因狀態(tài)與HER2蛋白表達(dá)明顯相關(guān)(P<0.05)。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌基因TOP2A和HER2基因狀態(tài)及 HER2蛋白表達(dá)見圖1。

    表1 TOP2A基因與HER2基因及HER2蛋白表達(dá)的關(guān)系 例(%)

    圖1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌基因狀態(tài)及蛋白表達(dá)

    2.2 TOP2A基因異常與臨床病理特征的關(guān)系

    由表2可見,TOP2A基因狀態(tài)與年齡、部位及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P>0.05);男性異常率高于女性,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);Ⅰ級(jí)異常率最低(3.03%),Ⅲ級(jí)異常率最高(30.91%),TOP2A基因狀態(tài)與病理組織學(xué)分級(jí)相關(guān)(P<0.05);TOP2A基因異常中伴有高級(jí)別導(dǎo)管原位癌的病例高于伴中、低級(jí)別導(dǎo)管原位癌的病例,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);腫瘤直徑為 2~5 cm時(shí)TOP2A基因擴(kuò)增和缺失率較高,腫瘤直徑與TOP2A基因狀態(tài)相關(guān)(P<0.05)。

    3 討論

    TOP2A基因是核基質(zhì)成分之一,在核內(nèi)發(fā)揮作用[14]。TOP2A作為調(diào)節(jié)核酸空間結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化、控制核酸生理功能的關(guān)鍵酶,在多種細(xì)胞中均有表達(dá),且在增殖細(xì)胞中呈周期性特異表達(dá)。TOP2A在腫瘤細(xì)胞的不同周期表達(dá)各異,一般表現(xiàn)為在DNA復(fù)制后期及有絲分裂期表達(dá)增加,有絲分裂期結(jié)束后表達(dá)有所下降,提示腫瘤增殖受TOP2A表達(dá)影響[15]。TOP2A基因參與乳腺癌細(xì)胞的復(fù)制,存在TOP2A基因異常的患者預(yù)后差,無復(fù)發(fā)生存期縮短,尤其是TOP2A基因缺失的患者預(yù)后更差。基因擴(kuò)增提示腫瘤有復(fù)發(fā)的可能,或者遠(yuǎn)期的療效下降。因此,正確檢測(cè)和評(píng)定乳腺癌中TOP2A狀態(tài)至關(guān)重要。

    表2 TOP2A基因與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

    TOP2A變異有兩種表現(xiàn)形式,分別是TOP2A基因拷貝數(shù)(判斷擴(kuò)增與否)和TOP2AmRNA表達(dá)。國外有文獻(xiàn)報(bào)道,乳腺癌TOP2A基因擴(kuò)增率為23.9%,基因缺失率為2.8%[16];國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道TOP2A基因擴(kuò)增率為12.6%~19.0%,未見有缺失報(bào)道[17-19]。本研究顯示,371例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者TOP2A基因異常率為20.49%,其中擴(kuò)增率為17.25%(64/371),與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符。TOP2A基因和HER2原癌基因均定位于染色體17q11.2-22,且二者相近。有研究表明[9],HER2與 TOP2A在乳腺癌中的表達(dá)存在一定相關(guān)性且共同影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展。明潔等[18]研究顯示,TOP2A擴(kuò)增及表達(dá)可能依賴于 HER2擴(kuò)增及表達(dá);TOP2A與HER2呈共表達(dá)[20],HER2蛋白過表達(dá)與基因擴(kuò)增存在一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示,HER2基因擴(kuò)增(122例)高于 TOP2A基因擴(kuò)增(64例),TOP2A與HER2基因共擴(kuò)增53例,達(dá)82.81%,二者呈明顯相關(guān),說明HER2基因表達(dá)可影響TOP2A基因表達(dá)。122例HER2基因擴(kuò)增中有60例TOP2A基因無擴(kuò)增或缺失,249例HER2無擴(kuò)增中有10例TOP2A基因擴(kuò)增,76例TOP2A基因擴(kuò)增和缺失中有13例HER2基因并無擴(kuò)增,這說明TOP2A與HER2基因雖具有相關(guān)性,但仍有各自獨(dú)立的因素存在。本研究中TOP2A基因擴(kuò)增隨HER2蛋白表達(dá)增強(qiáng)而增高,TOP2A基因缺失在HER2蛋白表達(dá)為3+時(shí)最高,說明HER2蛋白過表達(dá)不但與HER2基因擴(kuò)增相關(guān),與TOP2A基因異常也存在一定的相關(guān)性。此外我們發(fā)現(xiàn),TOP2A基因改變與患者年齡、性別和部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性,男性乳腺癌異常率雖然高于女性,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是由于樣本例數(shù)較少,還有待于積累病例數(shù)進(jìn)一步明確。浸潤性導(dǎo)管癌組織學(xué)分級(jí)越高,腫瘤細(xì)胞分化程度越差,TOP2A基因異常率就越高,而且腫瘤直徑為2~5 cm時(shí)TOP2A基因擴(kuò)增和缺失率較高。此外,76例TOP2A基因異常的浸潤性導(dǎo)管癌中有16例伴有不同分化程度的原位癌,以高級(jí)別原位癌為主,這可能是腫瘤在從原位癌發(fā)展為浸潤癌的過程中細(xì)胞增殖比較活躍導(dǎo)致異常率增高的原因。

    TOP2A是蒽環(huán)類抗生素的靶酶,TOP2A基因擴(kuò)增或缺失可影響蒽環(huán)類藥物的反應(yīng)及藥效[21-22],而HER2狀態(tài)對(duì)預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物的化療效果尚無定論。有研究報(bào)道[19],TOP2A可能比HER2對(duì)蒽環(huán)類藥物更有預(yù)測(cè)作用。因此,臨床在使用蒽環(huán)類藥物治療時(shí),應(yīng)分別進(jìn)行TOP2A及HER2基因檢測(cè),尤其是對(duì)HER2蛋白高表達(dá)、腫瘤組織分級(jí)高的患者。

    乳腺浸潤性導(dǎo)管癌TOP2A基因、HER2基因及蛋白的表達(dá)存在復(fù)雜性,但已成為乳腺癌治療和預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo),TOP2A基因檢測(cè)可能是乳腺浸潤性導(dǎo)管癌蒽環(huán)類藥物使用的重要依據(jù)。

    [1]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer JClin,2013,63(1):11-30.

    [2]Weiss JR,Moysich KB,Swede H.Epidemiology of male breast cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005,14(1):20-26.

    [3]Deb S,Jene N,Kconfab Investigators,et al.Genotypic and phenotypic analysis of familial male breast cancer shows under representation of the HER2 and basal subtypes in BRCA-associated carcinomas[J].BMC Cancer,2012,12:510.

    [4]O′Malley FP,Chia S,Tu D,et al.TopoisomeraseⅡalpha and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy[J].JNatl Cancer Inst,2009,101(9):644-650.

    [5]Tubbs R,Barlow WE,Budd GT,etal.Outcome of patients with early-stage breast cancer treated with doxorubicin-based adjuvant chemotherapy as a function of HER2 and TOP2A status[J].JClin Oncol,2009,27(24):3881-3886.

    [6]Simon G,Sharma A,Li X,etal.Feasibility and efficacy of molecular analysis-directed individualized therapy in advanced non-small-cell lung cancer[J].JClin Oncol,2007,25(19):2741-2746.

    [7]Slamon DJ,Press MF.Alterations in the TOP2A and HER2 genes:association with adjuvant anthracycline sensitivity in human breast cancers[J].JNatl Cancer Inst,2009,101(9):615-618.

    [8]華驍帆.早期非特殊性浸潤性乳腺癌TOP2a蛋白表達(dá)與分級(jí)、分期及分子分型相關(guān)性分析[D].蘇州:蘇州大學(xué),2016.

    [9]Siddiqa A,Long LM,Li L,etal.Expression of HER-2 in MCF-7 breast cancer cells modulates anti-apoptotic proteins Survivin and Bcl-2 via the extracellular signalrelated kinase(ERK)and phosphoinositide-3 kinase(PI3K)signalling pathways[J].BMC Cancer,2008,8:129.

    [10]許潔,陳潔,張科平,等.非特殊性浸潤性乳腺癌TOP2A基因狀態(tài)與分級(jí)、HER-2和Ki-67的相關(guān)性[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2015,31(5):576-578.

    [11]蔣奕,葉洪濤,姬逸男,等.乳腺組織 TOP2A和HER2/neu擴(kuò)增與臨床病理因素相關(guān)性研究[J].中華腫瘤防治雜志,2017,24(1):30-33.

    [12]Wolff AC,Hammon ME,Schwartz JN,et al.American Society of ClinicalOncology/College of American Pathologists guideline for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer[J].Arch Pathol Lab Med,2007,131(1):18-43.

    [13]Wolff AC,Hammond ME,Hicks DG,et al.Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer:American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update[J].J Clin Oncol,2013,31(31):3997-4013.

    [14]Brase JC,Schmidt M,F(xiàn)ischbach T,et al.ERBB2 and TOP2A in breast cancer:a comprehensive analysis of gene amplification,RNA levels,and protein expression and their influence on prognosis and prediction[J].Clin Cancer Res,2010,16(8):2391-2401.

    [15]Romero A,Caldés T,Díaz-Rubio E,etal.Topoisomerase 2 alpha:a real predictor of anthracycline efficacy?[J].Clin Transl Oncol,2012,14(3):163-168.

    [16]Badawy OM,Loay I.FISH analysis of TOP2A and HER-2 aberrations in female breast carcinoma on archived material:egyptian NCIexperience[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2017.[Epub ahead of print]

    [17]劉春萍,逯翀,田源,等.乳腺癌Her-2與TOP2A基因表達(dá)對(duì)新輔助化療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值[J].中國普通外科雜志,2010,19(11):1200-1203.

    [18]明潔,逯翀,田元,等.乳腺癌HER2與TOP2A的表達(dá)及其相關(guān)性[J].解剖學(xué)報(bào),2010,41(3):391-394.

    [19]張成娟,董鳳梅,徐本玲,等.Ki-67、Her-2及Top2A在乳腺癌中的擴(kuò)增表達(dá)與蒽環(huán)類藥物療效關(guān)系的研究[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2017,30(1):11-14.

    [20]湯小江,周瑜輝,張偉,等.TOP2A基因表達(dá)與乳腺癌HER-2通路的相關(guān)性[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,36(4):519-522,557.

    [21]Barinoff J,Traut A,Bauerschlag D,etal.Chemotherapy for 70-year-old women with breast cancer in Germany:a survey by the German breast group[J].Geburtshilfe Frauenheilkd,2013,73(5):433-439.

    [22]Gogia A,Raina V,Deo SV,et al.Taxane and anthracycline based neoadjuvant chemotherapy for locally advanced breast cancer:institutional experience[J].Asian Pac JCancer Prev,2014,15(5):1989-1992.

    猜你喜歡
    蒽環(huán)類浸潤性乳腺
    蒽環(huán)類藥物相關(guān)心律失常研究進(jìn)展
    基于靜息態(tài)fMRI探究蒽環(huán)類系統(tǒng)性治療后乳腺癌幸存者大腦局部一致性異常
    體檢查出乳腺增生或結(jié)節(jié),該怎么辦
    浸潤性乳腺癌超聲及造影表現(xiàn)與P63及Calponin的相關(guān)性
    得了乳腺增生,要怎么辦?
    媽媽寶寶(2017年2期)2017-02-21 01:21:22
    乳腺浸潤性微乳頭狀癌的研究進(jìn)展
    乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織β-catenin、cyclinD1、CDK4蛋白表達(dá)及臨床意義
    容易誤診的高回聲型乳腺病變
    NT-proBNP和超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)蒽環(huán)類藥物早期心臟毒性的臨床意義
    針吸治療乳腺增生
    黑丝袜美女国产一区| 麻豆av在线久日| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 99在线人妻在线中文字幕| а√天堂www在线а√下载| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲精品国产色婷婷电影| 中文字幕精品免费在线观看视频| 免费在线观看影片大全网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| a级毛片在线看网站| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | av免费在线观看网站| 成人三级黄色视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲午夜理论影院| 国产成人影院久久av| 亚洲欧美激情综合另类| 色综合婷婷激情| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 精品久久久精品久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久久久国内视频| 天堂影院成人在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 国产又爽黄色视频| 亚洲黑人精品在线| 天堂影院成人在线观看| 欧美日韩黄片免| 国产91精品成人一区二区三区| 夜夜爽天天搞| www.熟女人妻精品国产| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 国产三级黄色录像| 无人区码免费观看不卡| 9191精品国产免费久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久人妻熟女aⅴ| 99久久精品国产亚洲精品| 国产成人av激情在线播放| 日日爽夜夜爽网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日韩欧美国产一区二区入口| www.999成人在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲电影在线观看av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美日韩乱码在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| av电影中文网址| 最好的美女福利视频网| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一进一出好大好爽视频| 麻豆国产av国片精品| 日韩大尺度精品在线看网址 | 亚洲免费av在线视频| 91在线观看av| 国产真人三级小视频在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久香蕉激情| 久久久久久久久中文| 嫩草影视91久久| 亚洲人成77777在线视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| 免费少妇av软件| av视频在线观看入口| 老司机福利观看| 手机成人av网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 久久精品国产综合久久久| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 9热在线视频观看99| 在线观看免费视频网站a站| 免费搜索国产男女视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 操出白浆在线播放| 一级毛片高清免费大全| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 午夜福利视频1000在线观看 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 人人澡人人妻人| 国产成人欧美| 嫩草影院精品99| 国产亚洲欧美98| 99国产精品一区二区三区| 美女大奶头视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 中出人妻视频一区二区| 日韩精品中文字幕看吧| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 极品人妻少妇av视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 一级a爱片免费观看的视频| av网站免费在线观看视频| 黄色丝袜av网址大全| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久精品影院6| 在线观看免费午夜福利视频| 女性被躁到高潮视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人精品一区二区免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日韩高清综合在线| 91在线观看av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久精品91无色码中文字幕| 久久久久久久久免费视频了| 国产精品影院久久| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 9热在线视频观看99| 国产精品,欧美在线| 好男人在线观看高清免费视频 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 一夜夜www| 日本在线视频免费播放| 亚洲 国产 在线| 一夜夜www| 在线播放国产精品三级| 韩国精品一区二区三区| 久久亚洲真实| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品在线美女| 国产av精品麻豆| 老司机福利观看| 亚洲中文字幕日韩| 日韩欧美免费精品| 国产精品永久免费网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品久久蜜臀av无| 亚洲专区国产一区二区| 视频区欧美日本亚洲| 精品久久蜜臀av无| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲精品av麻豆狂野| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲黑人精品在线| 丝袜美足系列| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 在线观看免费日韩欧美大片| 看片在线看免费视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久久九九精品影院| 一本综合久久免费| 99国产精品免费福利视频| 精品无人区乱码1区二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文字幕色久视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产单亲对白刺激| 999久久久精品免费观看国产| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 性欧美人与动物交配| 国产精品免费视频内射| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 国产片内射在线| 午夜视频精品福利| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 天堂动漫精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久香蕉精品热| 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品国产一区二区精华液| 色哟哟哟哟哟哟| 99国产综合亚洲精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩精品青青久久久久久| 两个人视频免费观看高清| 9色porny在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 三级毛片av免费| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜视频精品福利| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲av成人一区二区三| 深夜精品福利| 亚洲avbb在线观看| 国产av在哪里看| 1024视频免费在线观看| 在线观看舔阴道视频| 久久精品国产清高在天天线| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产一区二区三区视频了| 国产精品av久久久久免费| 级片在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 日韩大码丰满熟妇| 欧美国产精品va在线观看不卡| 91精品三级在线观看| 精品久久蜜臀av无| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国内精品久久久久精免费| 美女免费视频网站| 美女 人体艺术 gogo| 一二三四在线观看免费中文在| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品一区av在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产在线精品亚洲第一网站| 午夜a级毛片| 中文字幕人妻熟女乱码| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久久久久精品吃奶| 91在线观看av| 天堂动漫精品| av天堂久久9| 国产av在哪里看| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲最大成人中文| 国产av精品麻豆| 欧美久久黑人一区二区| 精品人妻在线不人妻| 国产麻豆69| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 久久久久九九精品影院| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日本在线视频免费播放| 99re在线观看精品视频| 午夜老司机福利片| 999精品在线视频| 免费搜索国产男女视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久人妻av系列| 亚洲美女黄片视频| 无人区码免费观看不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 中国美女看黄片| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 免费在线观看完整版高清| 国产单亲对白刺激| 精品人妻1区二区| 制服诱惑二区| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 久久性视频一级片| 麻豆成人av在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品高清国产在线一区| 欧美日本中文国产一区发布| 9色porny在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 精品日产1卡2卡| 亚洲 国产 在线| 午夜福利视频1000在线观看 | 欧美色视频一区免费| 免费无遮挡裸体视频| 免费高清在线观看日韩| 亚洲 欧美一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久国产成人精品二区| 日韩免费av在线播放| a在线观看视频网站| 女性被躁到高潮视频| 国产精品爽爽va在线观看网站 | netflix在线观看网站| 99热只有精品国产| 亚洲第一电影网av| 啦啦啦免费观看视频1| bbb黄色大片| 午夜两性在线视频| 99riav亚洲国产免费| 99国产精品一区二区三区| 露出奶头的视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 日本欧美视频一区| 亚洲成国产人片在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久香蕉国产精品| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产成人免费无遮挡视频| 99热只有精品国产| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩成人在线观看一区二区三区| 性少妇av在线| 97碰自拍视频| 国产国语露脸激情在线看| 成人特级黄色片久久久久久久| 免费搜索国产男女视频| 欧美日韩精品网址| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美日韩福利视频一区二区| 999精品在线视频| 亚洲人成电影观看| 欧美成人午夜精品| 午夜免费激情av| 老司机在亚洲福利影院| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 免费看美女性在线毛片视频| 又黄又粗又硬又大视频| 久久中文字幕人妻熟女| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黄片播放在线免费| 亚洲久久久国产精品| 久久久久精品国产欧美久久久| av在线播放免费不卡| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品久久蜜臀av无| 日韩成人在线观看一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 国产野战对白在线观看| 国产亚洲欧美98| 亚洲伊人色综图| 无人区码免费观看不卡| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲成a人片在线一区二区| 此物有八面人人有两片| 可以在线观看的亚洲视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲人成电影观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久久九九精品影院| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产99久久九九免费精品| 亚洲,欧美精品.| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品久久久久久精品电影 | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美一区二区精品小视频在线| 国产av又大| 中文亚洲av片在线观看爽| 又大又爽又粗| 少妇 在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 人妻久久中文字幕网| 国产真人三级小视频在线观看| 91麻豆av在线| 久热这里只有精品99| 日本三级黄在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品 欧美亚洲| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲avbb在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 久久久久精品国产欧美久久久| 两个人免费观看高清视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品一品国产午夜福利视频| 正在播放国产对白刺激| 欧美黑人欧美精品刺激| 黄色毛片三级朝国网站| 成在线人永久免费视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲色图av天堂| 久久久久久久久久久久大奶| 在线观看免费视频日本深夜| 午夜福利在线观看吧| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品久久视频播放| 动漫黄色视频在线观看| 麻豆国产av国片精品| 午夜视频精品福利| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久草成人影院| 美女午夜性视频免费| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 丰满的人妻完整版| av天堂久久9| 欧美黄色片欧美黄色片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产一区二区激情短视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 一二三四在线观看免费中文在| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 老司机靠b影院| 69精品国产乱码久久久| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品久久电影中文字幕| 99热只有精品国产| 波多野结衣巨乳人妻| 99国产综合亚洲精品| 日韩国内少妇激情av| 久久亚洲真实| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 91九色精品人成在线观看| 91av网站免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 高清毛片免费观看视频网站| 国产高清视频在线播放一区| 国产97色在线日韩免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 操出白浆在线播放| 国产三级在线视频| 校园春色视频在线观看| 宅男免费午夜| 免费在线观看日本一区| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲专区字幕在线| 日韩av在线大香蕉| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 美女免费视频网站| 国产高清videossex| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 一级毛片高清免费大全| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 神马国产精品三级电影在线观看 | 黄色片一级片一级黄色片| 色在线成人网| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成人精品一区二区免费| 满18在线观看网站| 亚洲精品在线美女| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 最近最新中文字幕大全电影3 | 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲专区字幕在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久久久免费高清国产稀缺| 无人区码免费观看不卡| 久久狼人影院| 色尼玛亚洲综合影院| 十八禁网站免费在线| 亚洲午夜理论影院| 一级片免费观看大全| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人av教育| 亚洲成人精品中文字幕电影| 正在播放国产对白刺激| 色综合站精品国产| www日本在线高清视频| 丝袜人妻中文字幕| 97碰自拍视频| 午夜久久久在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | 老司机在亚洲福利影院| 一区在线观看完整版| 午夜影院日韩av| 成人18禁在线播放| 久久久久久久午夜电影| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 青草久久国产| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美乱码精品一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 99国产精品免费福利视频| 精品久久久精品久久久| 丝袜人妻中文字幕| 精品人妻1区二区| svipshipincom国产片| 黄色视频不卡| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 国产野战对白在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲色图av天堂| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产野战对白在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄色视频,在线免费观看| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日韩成人在线观看一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲熟女毛片儿| 老司机午夜十八禁免费视频| 丰满的人妻完整版| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 欧美激情高清一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽| 极品人妻少妇av视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 波多野结衣巨乳人妻| 母亲3免费完整高清在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| www国产在线视频色| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 高清毛片免费观看视频网站| 国产野战对白在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品国产亚洲在线| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲av美国av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| av超薄肉色丝袜交足视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日韩欧美在线二视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产xxxxx性猛交| 国产成人av激情在线播放| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产午夜福利久久久久久| 中文字幕色久视频| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美日韩一级在线毛片| 一区二区日韩欧美中文字幕| 丝袜美足系列| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜福利18| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久人妻熟女aⅴ| 老司机靠b影院| 亚洲avbb在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久中文看片网| 又黄又粗又硬又大视频| 波多野结衣一区麻豆| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 日韩免费av在线播放| 日本三级黄在线观看| 嫩草影院精品99| 激情视频va一区二区三区| 99久久综合精品五月天人人| 久久香蕉国产精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产亚洲欧美98| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产99白浆流出| 久久久久国产一级毛片高清牌| www.999成人在线观看| 曰老女人黄片| 国产成人av教育| 国产91精品成人一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品欧美国产一区二区三| 男女下面进入的视频免费午夜 | 9热在线视频观看99| 国内精品久久久久久久电影| 午夜免费观看网址| 超碰成人久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 丰满的人妻完整版| 一本大道久久a久久精品| 99精品久久久久人妻精品| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 波多野结衣一区麻豆| 两个人免费观看高清视频| 一本综合久久免费| 在线观看日韩欧美| 午夜免费观看网址| 天天一区二区日本电影三级 | 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成人精品一区二区免费| 国产精华一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 青草久久国产| 日本 av在线| 久久精品国产综合久久久| 后天国语完整版免费观看| 午夜福利一区二区在线看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费在线观看黄色视频的| 他把我摸到了高潮在线观看|