紅曲霉產(chǎn)色素和桔霉素影響因素的研究進(jìn)展

黃 娟，姚若一，黃邵培，劉思芬，鄧 穎，王偉平

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068）

紅曲霉是散囊菌目中的一屬子囊菌曲霉科真菌，紅曲霉利用各種碳源和氮源合成紅曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸、桔霉素等代謝產(chǎn)物。紅曲色素作為一種天然色素，被廣泛的用于食品行業(yè)和化妝品中，紅曲色素有廣泛的生物活性，例如抑制細(xì)胞癌變、抗菌活性、清除活性氧和抗突變體等作用。而桔霉素具有腎毒性，可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎臟腫大、尿量增多，腎小管擴(kuò)張和上皮細(xì)胞變性壞死等，還可能誘發(fā)腫瘤，導(dǎo)致畸變、突變。桔霉素的存在大大限制了紅曲色素的應(yīng)用。因此，我們要找到高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素的對(duì)策。

1 菌種及菌種改造

紅曲色素安全性高、用處廣，故當(dāng)前很多科研人員對(duì)紅曲色素的生產(chǎn)和研究產(chǎn)生了很大的興趣，為得到高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素的方法進(jìn)行了一系列研究，而目前研究主要使用的菌種有：M.purpureus、M.ruber、M.fuligmosus，M.anka、M.rubigino-sus、M.bakeri、M.albidus和M.serorubescens[1]這8種，并以紫色紅曲霉、紅色紅曲霉使用最為廣泛。此外，還有部分科研人員所用菌種是直接從某些地方取材，類別沒有進(jìn)行鑒定。

傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法誘變可以提高色素產(chǎn)量，降低桔霉素產(chǎn)量。呂旭聰?shù)萚2]采用物理化學(xué)復(fù)合誘變（紫外誘變和氯化鋰誘變）的方法得到了高產(chǎn)色素的突變菌；王軒等[3]通過紫外誘變和濃度為5%的硫酸二乙酯誘變后，分離篩選得到1株突變株G009-UV-D-9，該菌株與原始菌株相比較桔霉素含量降低了90%以上。

傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變不能定向突變得到所需菌株，且耗時(shí)長(zhǎng)，成功概率低。近年來研究者通過基因工程技術(shù)，如重疊延伸PCR技術(shù)，真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物異源表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建等，在分子水平上對(duì)紅曲霉基因進(jìn)行一定的改造，從而降低桔霉素的產(chǎn)量，提高色素產(chǎn)量。柳燕[4]以福建紅曲霉M-CL為出發(fā)菌株,通過重疊延伸PCR技術(shù)融合片段與帶有潮霉素抗性的PSKH質(zhì)粒，得到了理想的基因敲除菌株，較原始菌株桔霉素產(chǎn)量降低41.8%，色素產(chǎn)量提高11%。Sakai等[5]構(gòu)建了桔霉素的異源表達(dá)系統(tǒng),得到的菌株桔霉素產(chǎn)量也有所降低。

通過微生物混合發(fā)酵方法可以降低桔霉素的生成。研究顯示將紅曲霉與酵母菌或米曲霉共培養(yǎng)可以顯著提高色素的產(chǎn)量，相比單培養(yǎng)，共培養(yǎng)可以使菌體質(zhì)量增加2倍，色素產(chǎn)量增加30～40倍[6]。張建玲[7]在液態(tài)發(fā)酵時(shí)分別接入酵母菌和乳酸菌與紅曲菌株混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與單純紅曲菌株培養(yǎng)相比色素產(chǎn)量有所提高，桔霉素的產(chǎn)生也被抑制。

2 培養(yǎng)基

2.1 氮源

選擇合適的氮源有利于色素生成。岳建明等[8]發(fā)現(xiàn)，以硝酸鈣、硝酸鈉、尿素為氮源時(shí)，發(fā)酵液呈紅色；以氯化銨、硝酸銨、硫酸銨為氮源時(shí)，發(fā)酵液呈黃色。侯敏等[9]發(fā)現(xiàn)，以硝酸銨為氮源時(shí)，細(xì)胞內(nèi)色素產(chǎn)量較高，而以硫酸銨為氮源時(shí)，細(xì)胞外色素產(chǎn)量較高。有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更利于紅曲霉色素合成[10]。

不同的氮源對(duì)于桔霉素的合成有不同的影響。甘氨酸、酪氨酸、精氨酸、絲氨酸和組氨酸，可以抑制桔霉素的合成，同時(shí)可促進(jìn)紅曲色素的產(chǎn)生，其中組氨酸的效果最好[11-12]。氮源為甲硫氨酸、尿素時(shí)，桔霉素的合成受到抑制[13]，但色素的產(chǎn)量也隨之降低。而谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸作為氮源時(shí)，桔霉素的產(chǎn)量增加。

2.2 碳源

合適的碳源能夠影響紅曲霉色素的生成。侯敏等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉在以甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及淀粉為單一碳源的發(fā)酵液中生長(zhǎng)良好。楊成龍等[14]發(fā)現(xiàn)，碳源的添加濃度為4%～5%時(shí)，最適宜紅曲霉S產(chǎn)色素，以甘露醇為單一碳源的色價(jià)最高，其次是大米粉，兩者色調(diào)均偏紅；葡萄糖與蔗糖的色調(diào)偏黃，但總色價(jià)偏低。

2.3 pH值

研究表明，培養(yǎng)基pH值能影響紅曲霉菌的活性，從而影響產(chǎn)色[15]。王紅等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)：不同的初始pH值，會(huì)影響紅曲霉的生長(zhǎng)速度，從而影響色素的產(chǎn)量。偏酸環(huán)境有利于紅曲色素的生成，色價(jià)也較高;在堿性環(huán)境下菌絲體基本不生長(zhǎng)，色價(jià)也很低[17]。

不同pH值對(duì)紅曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物色價(jià)、桔霉素都會(huì)產(chǎn)生影響。有研究表明，堿性條件下可促使細(xì)胞內(nèi)的紅曲色素排出并且顯著抑制桔霉素的產(chǎn)生[18]。也有研究顯示，低pH值條件下的發(fā)酵可以得到不含桔霉素的產(chǎn)物，其色素合成并沒有受到影響，反而比高pH值條件下的產(chǎn)量要高，并主要為胞內(nèi)色素[19]。

2.4 金屬離子

添加Fe2+能使培養(yǎng)基中色素的含量上升[20]。而加入某些金屬離子能夠影響桔霉素的合成，加入Mg2+色素的產(chǎn)量雖不受影響，但卻促進(jìn)了桔霉素的生成[21]，所以培養(yǎng)基中最好不要加入鎂離子。而加入金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA），可以螯合金屬離子，能夠抑制桔霉素的生成[6]。

3 培養(yǎng)條件

3.1 光照

光照作為外界環(huán)境改變的信號(hào)分子，可誘導(dǎo)包括絲狀真菌在內(nèi)的多種生物生長(zhǎng)發(fā)育和次級(jí)代謝產(chǎn)物的改變[22]。因此深入了解光信號(hào)在真菌生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用，對(duì)于研究包括紅曲霉在內(nèi)的非光合微生物的代謝具有重要意義[23]。

在紅光照射培養(yǎng)條件下，紅曲色素合成期持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，色素產(chǎn)量高于黑暗培養(yǎng)條件，同時(shí)在一定程度上減少了桔霉素的生成[24-25]。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，相比黑暗條件，藍(lán)光條件下紅曲色素增產(chǎn)28.5%，桔霉素減產(chǎn)79%，但在藍(lán)光光照條件下紅曲色素穩(wěn)定性比較差。

3.2 溫度

變溫培養(yǎng)時(shí)紅曲霉菌體生長(zhǎng)緩慢，造成紅曲霉產(chǎn)桔霉素量增加；恒溫培養(yǎng)更適合菌體生長(zhǎng)，并且能夠激發(fā)菌體分泌色素[27]。苗玉志等[28]發(fā)現(xiàn)，菌株在不同的培養(yǎng)溫度下生長(zhǎng)和產(chǎn)紅曲色素的能力不一樣，最佳的生長(zhǎng)溫度為35℃，最適宜的產(chǎn)紅曲色素溫度為30℃?？刂坪线m的發(fā)酵溫度，可以有效降低液態(tài)發(fā)酵中桔霉素的生成[29]。許贛榮等[30]提出液態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)溫度為36℃時(shí)，紅曲霉高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素。而李培睿等[31]的研究也表明35℃有利于紅曲霉的生長(zhǎng)，且此溫度條件下桔霉素產(chǎn)量相對(duì)較低。

3.3 溶氧

溶氧與發(fā)酵過程中微生物的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的代謝密切相關(guān)，紅曲霉液態(tài)發(fā)酵時(shí)，隨著通氣量的增加或攪拌速度的提高，菌體的生物量和次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量都有所增加，但是桔霉素的增加比例比色素的大[32-33]。顧玉梅等[11]的研究也證實(shí)了高溶氧對(duì)色素及桔霉素生成都有促進(jìn)作用。因此，在產(chǎn)物生成階段，可盡量降低通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，使溶氧保持在一個(gè)較低的水平，以增加紅曲色素與桔霉素的產(chǎn)量比值。

4 結(jié)語

在菌種層面，通過選取優(yōu)良菌種，菌種改造及混菌發(fā)酵的方法可以達(dá)到高產(chǎn)色素，低產(chǎn)桔霉素的目的；配制培養(yǎng)基時(shí)，以銨鹽為氮源，合適的糖為碳源，低pH值，選擇性添加某些金屬離子可以使色素的產(chǎn)量提高；而用組氨酸等氨基酸為氮源還可降低桔霉素的產(chǎn)量，培養(yǎng)條件為紅光，35℃，低溶氧量時(shí)，也可實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素。紅曲色素在食品行業(yè)應(yīng)用廣泛，色素代謝時(shí)產(chǎn)生的桔霉素會(huì)威脅人們的健康，降低生產(chǎn)過程中桔霉素的含量，讓紅曲色素真正具有安全性。

[1]LU W,XU X.Research status and application prospects of Monascus sp[J].Agricultural science&technology,2015,16(1)：192-196.

[2]呂旭聰,童愛均,鐘春梅,等.福建紅曲中高產(chǎn)色素紅曲菌的篩選及其誘變育種研究[J].中國(guó)調(diào)味品,2016(7)：61-68.

[3]王軒,武亞明,李靜靜,等.一株低產(chǎn)桔霉素紅曲菌種的篩選[J].中國(guó)食品添加劑,2013(5)：138-141.

[4]柳燕.高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素的福建紅曲菌種構(gòu)建[D].福州:福建師范大學(xué),2015.

[5]SAKAI K,KINOSHITA H,SHIMIZU T,et al.Construction of acitrin in genecluster expression system in heterologous Asperg illusoryzae[J].Journal of bioscience&bioengineering,2008,106(5)：466-472.

[6]石侃,夏楓耿,吳振強(qiáng).紅曲色素發(fā)酵生產(chǎn)過程桔霉素控制技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造,2016(4)：1-6.

[7]張建玲.混菌發(fā)酵對(duì)紅曲霉產(chǎn)色素及桔霉素的影響[D].天津：天津科技大學(xué),2012.

[8]岳建明,楊強(qiáng),肖瀟,等.銨鹽對(duì)紫色紅曲霉合成代謝紅曲色素及桔霉素的影響[J].食品科學(xué),2016(5)：102-107.

[9]侯敏,王艷新,唐帥,等.不同碳源、氮源對(duì)紅曲發(fā)酵產(chǎn)色素的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(9)：1119-1122.

[10]張健明,何鋼,劉嵬,等.水溶性紅曲色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化[J].食品科技,2015(9)：252-257.

[11]顧玉梅,許贛榮,陳蘊(yùn),等.紅曲霉菌9903發(fā)酵工藝條件對(duì)色素及桔霉素生產(chǎn)的影響[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2002,21(1)：43-47.

[12]陳蘊(yùn),夏永軍,許贛榮,等.紅曲液態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素的工藝條件[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007(10)：10-13.

[13]BLANC P J,LORET M O,GOMA G.Production of citrinin by various species of Monascus[J].Biotechnol lett,1995,17(3)：291-294.

[14]楊成龍,楊曉君,何志剛,等.碳氮源對(duì)紅曲霉S產(chǎn)色素的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011(5)：832-836.

[15]劉兆璽,杜金華,王曉曉,等.安卡紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素及糖化酶的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007(4)：77-81.

[16]王紅,王娜,肖軍,等.抗氧化劑和pH值對(duì)紅曲霉色素及生物量的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(5)：495-496.

[17]郭紅珍,王秋芬,馬立芝.不同培養(yǎng)條件對(duì)紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的研究[J].食品科學(xué),2008(1)：215-218.

[18]OROZCO S F B,KILIKIAN B V.Effect of pH on citrinin and red pigments production by Monascus purpureus CCT3802[J].World j microb biot,2008,24(2)：263-268.

[19]KANG B,ZHANG X,WU Z,et al.Production of citrinin-free Monascus pigments by submerged culture at low pH[J].Enzyme microb tech,2014(55)：50-57.

[20]楊東成,錢學(xué)紅,黃瑩琪,等.Cu2+、Fe2+和 Fe3+對(duì)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素影響[J].中國(guó)食品添加劑,2017(4)：100-102.

[21]虞慧玲,聶小華,許贛榮.低桔霉素紅曲色素液態(tài)發(fā)酵工藝的研究[J].中國(guó)釀造,2005(9)：21-24.

[22]趙燕莉.光照對(duì)桔青霉生長(zhǎng)發(fā)育和美伐他汀生物合成的影響[D].重慶：西南大學(xué),2013.

[23]張徐蘭,吳天祥,李鵬.紅曲霉有效成分應(yīng)用研究進(jìn)展[J].釀酒科技,2006(9)：78-81.

[24]王昌祿,張曉偉,陳勉華,等.紅光對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)及次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2009,(01)：91-95.

[25]殷賀中,祝美云.紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2010(12)：7-9.

[26]WANG C,FU Z L,CHEN M H,et al.Blue light effects on pigment and citrinin production in Monascus[C]//3rd International Conference on Biomedical and Bioinformatics Engineering.IEEE,2009：1-4.

[27]張紅梅,靳賽,伍家發(fā),等.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵控制條件對(duì)色素及桔霉素生產(chǎn)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(17)：7066-7067.

[28]苗玉志,鄔應(yīng)龍.產(chǎn)紫紅色素紅曲霉菌的篩選及生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)食品添加劑,2007(4)：93-97.

[29]WANG Y R,CHEN M H,WANG C,et al.Restriction of citrinin accumulation in Monascus by improving culture temperature[C]//3rd International Conference on Biomedical and Bioinformatics Engineering.IEEE,2009：1-4.

[30]許贛榮.紅曲桔霉素的檢測(cè)及發(fā)酵控制技術(shù)[D].無錫：江南大學(xué),2005.

[31]李培睿,張曉偉,郭孝輝,等.溫度對(duì)紅曲霉15-1產(chǎn)桔霉素的影響[J].中國(guó)食品添加劑,2015(3)：84-87.

[32]HAJJAJ H,BLANC P J,GROUSSAC E,et al.Improvement of red pigment/citrinin production ratioasafunction of environmental conditions by Monascus ruber[J].Biotechnol bioeng,1999,64(4)：497-501.

[33]PEREIRA D G,TONSO A,KILIKIAN B V.Effect of dissolved oxygen concentration on red pigment and citrinin production by Monascus purpureus ATCC36928[J].Braz j chem eng,2008,25(2)：247-253.