腸道病毒71型非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展

董禎 溫紅玲

250012濟(jì)南,山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院微生物檢驗(yàn)學(xué)系感染性疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(山東省“十三五”高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

自1969年在美國(guó)加利福尼亞分離出來至今，EV71已在全世界發(fā)生過多次暴發(fā)和流行，是亞太地區(qū)最嚴(yán)重的嗜神經(jīng)病毒之一。EV71導(dǎo)致的手足口病(hand， foot and mouth disease，HFMD)大部分為自限性疾病，常表現(xiàn)為手足口部位的皰疹，重癥患兒可伴有腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣急性遲緩性麻痹、腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，部分患者出現(xiàn)肺出血、肺水腫甚至心肺衰竭等其他嚴(yán)重的全身性疾病，致殘率及病死率較高[1-2]。近年來，EV71發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)，且重癥感染較多，對(duì)嬰幼兒的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅[2-3]。EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬A組，為單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)約7 400 bp，兩端分別是保守的是5‘UTR和3’UTR，中間是編碼一個(gè)多聚蛋白的開放閱讀框(open reading frame，ORF)。該多聚蛋白在自身蛋白酶的作用下水解為結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染過程中發(fā)揮各自作用[4]。研究顯示EV71的非編碼區(qū)可以與宿主相互作用，能在病毒RNA合成的起始階段及蛋白翻譯過程中對(duì)病毒感染發(fā)揮重要的調(diào)控作用。因此，研究EV71非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，對(duì)于揭示其致病機(jī)理及病毒的生命活動(dòng)具有重要意義。

1 EV71 5′非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)及功能

1.1 5′UTR結(jié)構(gòu) EV71的5′UTR是病毒基因組較為保守的區(qū)域，能折疊成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要由6個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop，SL)構(gòu)成。臨近5′末端的莖環(huán)Ⅰ是三葉草樣結(jié)構(gòu)(cloverleaf)，能與宿主蛋白發(fā)生相互作用，參與調(diào)控RNA的復(fù)制及合成，并且與維持病毒基因組結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)[5]。SLIISLVI共同組成內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)，以不依賴帽子結(jié)構(gòu)的方式與宿主細(xì)胞核糖體結(jié)合從而在病毒進(jìn)入細(xì)胞后啟動(dòng)病毒基因組的翻譯，并通過宿主因子調(diào)控病毒RNA的翻譯效率[6]。IRES中的SLIII和SLIV是相對(duì)保守的區(qū)域，SLII，SLV和SLVI則具有多變性，可能影響病毒毒力[7]。莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)部含有三個(gè)C-rich區(qū)，一個(gè)在SLII之前，另外兩個(gè)位于SLIV中。在SLV的下游還有一個(gè)富嘧啶(pyrimidine-rich)區(qū)，富嘧啶區(qū)的下游有一個(gè)沉默密碼子AUG，不能啟動(dòng)高效率的翻譯，而真正的翻譯起始位點(diǎn)AUG位于其下游約150 bp處[8]。目前，在IRES的SLVI和第一個(gè)AUG密碼子之間沒有預(yù)測(cè)到RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，該區(qū)域被定義為“連接區(qū)”[9]。連接區(qū)可能通過與宿主蛋白相互作用調(diào)節(jié)IRES的活性進(jìn)而調(diào)控病毒翻譯過程，但具體機(jī)制仍然未知。

1.2 5′UTR功能研究 小RNA病毒的IRES被分為4種類型，主要取決于它們需要輔助宿主蛋白在內(nèi)部招募核糖體的程度。EV71的IRES已被證明在功能上類似于Ⅰ型IRES，能與多種宿主蛋白相互作用，對(duì)病毒的復(fù)制和翻譯至關(guān)重要[10]。遠(yuǎn)端上游結(jié)合蛋白1(FBP1)通過正調(diào)節(jié)IRES活性可作為病毒翻譯的正調(diào)控因子，而最新研究表明遠(yuǎn)端上游結(jié)合蛋白3(FBP3)能夠通過結(jié)合EV71 5′UTR作為IRES相關(guān)作用因子(ITAF)并負(fù)調(diào)節(jié)病毒翻譯[6，9]。poly(C)結(jié)合蛋白1(PCBP1)通過與5′UTR相互作用正向調(diào)節(jié)EV71復(fù)制，其中SLI和SLIV空間結(jié)構(gòu)對(duì)PCBP1與病毒RNA結(jié)合尤為重要，可能影響病毒復(fù)制能力[11]。此外，異源核糖核蛋白(hnRNP)家族的成員，例如，聚嘧啶結(jié)合蛋白(PTB)，poly(C)結(jié)合蛋白2(PCBP2)，富含 AU的元件結(jié)合因子1(AUF1)等均被發(fā)現(xiàn)充當(dāng)ITAF，通過與5′UTR不同區(qū)域結(jié)合直接調(diào)節(jié)IRES活性，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究[9，12]。

研究表明5′UTR某些位點(diǎn)突變可能使病毒復(fù)制能力、嗜神經(jīng)性甚至毒力發(fā)生一定的變化。Ma等[13]通過比較置換了5′UTR的EV71重組病毒與原病毒的生長(zhǎng)曲線后發(fā)現(xiàn)，5′UTR能夠影響EV71復(fù)制能力且高溫下病毒復(fù)制能力有所下降，這提示可能存在EV71毒力位點(diǎn)或者高溫敏感位點(diǎn)。Yeh等[14]在EV71基因組的5′UTR的第158位點(diǎn)處進(jìn)行點(diǎn)突變(C158U)后發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制能力降低，進(jìn)一步通過ICR小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病毒致病力減弱，這說明C158位點(diǎn)是EV71的毒力決定位點(diǎn)。張慧娟等[15]通過多個(gè)病毒序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在5′UTR區(qū)中第254位堿基的突變(A254G)可能與EV71感染后引起的不同臨床癥狀有關(guān)。袁曉晶等[16]通過對(duì)EV71不同表型毒株基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離自中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)累及的6個(gè)病毒株在5′UTR區(qū)第265 nt、703 nt兩處均發(fā)生了變異(G265A，G703T)，而輕癥HFMD來源的病毒株在該位點(diǎn)未發(fā)生變異。這些研究說明5′UTR某些位點(diǎn)突變能夠引起不同臨床結(jié)局，可能與EV71的致神經(jīng)毒性作用有關(guān)，可作為潛在的毒力位點(diǎn)進(jìn)一步研究。

Wen等[16]通過基因序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)EV71輕癥株和重癥株5′UTR之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有明顯區(qū)別。Li等[17]比對(duì)25株EV71重癥分離株與31株輕癥株的序列發(fā)現(xiàn)5′UTR內(nèi)3處堿基位置上的核苷酸(nt272G，nt488U，nt700 A/U)發(fā)生了一致性改變，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示nt488U突變引起SLIII的穩(wěn)定性發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致病毒毒力變化引起不同表現(xiàn)型。Kok等[18]將 EV71的 5′UTR替換成鼻病毒(rhinovirus)的5′UTR后發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制能力變?nèi)?，然而多次?xì)胞傳代后恢復(fù)了親本的復(fù)制能力，分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)認(rèn)為U461C突變?cè)黾恿薙LV區(qū)域GC配對(duì)含量，使二級(jí)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，從而提高了翻譯效率使得病毒復(fù)制增強(qiáng)。Jia等對(duì)EV71強(qiáng)毒株的IRES二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，GP114→CP114和GP151→TP151突變有助于在SLII中形成獨(dú)特的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致病毒毒力增強(qiáng)[19]。最新研究表明，SLII內(nèi)部堆疊形成保守的5′-AUAGC-3′凸環(huán)結(jié)構(gòu)是病毒翻譯和復(fù)制的關(guān)鍵決定因素，當(dāng)內(nèi)部堿基突變后病毒復(fù)制能力降低，刪除凸環(huán)結(jié)構(gòu)則病毒完全失去感染RD細(xì)胞的能力[20]。人異源核糖核蛋白(hnRNP A1)與SLII相互作用形成特異性復(fù)合物，SLII凸環(huán)等結(jié)構(gòu)突變能改變復(fù)合物的穩(wěn)定性，嚴(yán)重影響病毒翻譯和復(fù)制能力[21]。另有研究初步表明，從重癥以及死亡患者分離出的EV71毒株的5′UTR RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)比輕癥毒株的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜和緊湊，尤其是在IRES的SLIV區(qū)，且重癥株有比輕癥株具有更多莖環(huán)結(jié)構(gòu)[22]。目前對(duì)EV71復(fù)制能力及毒力與5′UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)改變的關(guān)系研究逐漸增多，但由于其序列復(fù)雜且結(jié)構(gòu)具有高度靈活性，其三維結(jié)構(gòu)仍然未知，今后對(duì)空間三維折疊構(gòu)象的深入分析是必不可少的一方面。

研究發(fā)現(xiàn)位于三葉草結(jié)構(gòu)與SLII之間的非莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)第104位堿基是柯薩奇病毒16型(CA16)的毒力決定位點(diǎn)，與病毒復(fù)制有關(guān)并且影響由IRES介導(dǎo)的翻譯活性[23]。同一區(qū)域內(nèi)，脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus，PV)第103位堿基由A突變?yōu)镃后病毒的毒力發(fā)生衰減，并且喪失了在神經(jīng)細(xì)胞上的溫度敏感表型[24]。另有研究者發(fā)現(xiàn)，在三葉草結(jié)構(gòu)與IRES之間的部分堿基與三葉草結(jié)構(gòu)之間存在協(xié)同作用，通過增加宿主蛋白結(jié)合的能力調(diào)節(jié)病毒復(fù)制[25]。另外，對(duì)于連接區(qū)研究較少，目前認(rèn)為連接區(qū)可以促進(jìn)IRES三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)病毒構(gòu)象有重要意義，該區(qū)域的變異可能對(duì)毒力也有一定影響。這提示我們不能忽略對(duì)IRES以外的其他區(qū)域的堿基突變和空間結(jié)構(gòu)的關(guān)注。

2 EV71 3′非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)及功能

2.1 3‘UTR結(jié)構(gòu) EV71的3’UTR也是高度保守的非編碼區(qū)的一部分，它具有多種高度復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，此區(qū)域可能包含病毒基因組復(fù)制的調(diào)控位點(diǎn)。3′UTR的核心結(jié)構(gòu)是由堿基互補(bǔ)配對(duì)折疊形成的兩個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)域(stem-loop domains，SLDs)，分別稱為X和Y。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度是保守的，分別由8個(gè)堿基對(duì)和12個(gè)堿基對(duì)組成。3′UTR一端由遺傳編碼的poly(A)尾部組成，其部分包含在結(jié)構(gòu)域X的莖中[26]。X和Y結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)與環(huán)外的堿基配對(duì)可進(jìn)一步形成互補(bǔ)假結(jié)體，把這種能相互作用并且類似“吻型”(kissing interaction)的高級(jí)結(jié)構(gòu)命名為結(jié)構(gòu)域K。結(jié)構(gòu)域K的穩(wěn)定性不高，常以變換折疊的不同結(jié)構(gòu)存在。近期研究發(fā)現(xiàn)，3′UTR除了X和Y兩個(gè)莖環(huán)外還具有特殊的“Z型”結(jié)構(gòu)域(SLDZ)。根據(jù)核苷酸序列的長(zhǎng)短分為兩組，EV71 B3和C4亞型與 CVA4，CVA14和 CVA16等攜帶Ⅰ組SLD-Z，EV71原型株BrCr與其余亞型都攜帶Ⅱ組SLD-Z。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，SLD-Z是EV71和A型柯薩奇病毒16(CVA16)進(jìn)化重組的標(biāo)記[18，27]。值得一提的是，SLD Z的缺失能夠?qū)е虏《驹谏窠?jīng)元細(xì)胞(SH-SY5Y)的特異性生長(zhǎng)缺陷，很可能與神經(jīng)毒力有關(guān)[28]?！癦型”結(jié)構(gòu)域在病毒的復(fù)制過程中也可能發(fā)揮其他作用，但目前未見報(bào)道。

2.2 3′UTR功能及探究 目前研究認(rèn)為，3′UTR可能與病毒的進(jìn)化和適應(yīng)存在一定關(guān)聯(lián)，部分序列結(jié)構(gòu)缺失可能導(dǎo)致病毒感染性降低[29]。Kok等[18]刪除EV71和鼻病毒2嵌合體的3′UTR的17個(gè)堿基后，病毒的生長(zhǎng)能力大幅度下降。Brown等[30]構(gòu)建了刪除鼻病毒和PV的3′UTR的缺失突變體，然后用突變體感染Hela細(xì)胞，結(jié)果表明缺失突變體感染HeLa細(xì)胞的能力降低，細(xì)胞出現(xiàn)病變的時(shí)間推遲[30]。

作為非編碼區(qū)的一部分，3′UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)RNA的起始要比堿基組成對(duì)于RNA的起始更為重要，增加二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可以提高翻譯中涉及的蛋白質(zhì)的結(jié)合，這又可以提高翻譯效率。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)域K內(nèi)個(gè)別堿基錯(cuò)配造成的扭曲能導(dǎo)致病毒對(duì)溫度敏感甚至死亡，如果結(jié)構(gòu)域K中一條鏈被互補(bǔ)相似物取代則病毒復(fù)制被阻斷[31]。這種特殊的結(jié)構(gòu)域K可能為翻譯起始因子和核糖體相互識(shí)別提供了結(jié)合位點(diǎn)，也可能激活I(lǐng)RES活性進(jìn)而影響病毒翻譯過程，對(duì)EV71結(jié)構(gòu)域K的功能研究需要找到特定作用位點(diǎn)再聯(lián)合其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析。目前，對(duì)3′UTR結(jié)構(gòu)和功能的研究還處于起步階段，常用手段就是結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后進(jìn)行突變分析。但是對(duì)3′UTR功能的剖析常常受到病毒復(fù)制過程中各種因素的阻礙，我們需要通過進(jìn)一步研究來明確EV71與宿主的相互作用及其空間構(gòu)象變化對(duì)病毒的影響機(jī)制。

3 小結(jié)

在過去的幾十年里，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)小RNA病毒基因組非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了大量研究，其研究成果對(duì)我們了解EV71病毒基因組的復(fù)制，蛋白翻譯及病毒包裝釋放等生命過程具有重要意義。EV71高度保守且空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的非編碼區(qū)在入侵宿主細(xì)胞后的翻譯及復(fù)制過程中的作用不可或缺的，能直接或間接影響病毒的毒力和感染力。隨著對(duì)EV71研究的逐漸廣泛深入和研究技術(shù)的日益發(fā)展，非編碼區(qū)的功能及分子機(jī)制將逐步揭示。

利益沖突 無