腫瘤干細胞研究進展

潘有禮，趙成建，趙玉偉

作者單位：610213 成都，國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作四川中心（潘有禮）；610041 成都，四川大學華西校區(qū)生物治療國家重點實驗室（趙成建）；610041 成都市血液中心（趙玉偉）

腫瘤是目前嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一[1]。近年來，隨著生物科技的進步以及腫瘤生物學的發(fā)展，腫瘤的臨床治療取得了顯著的進步，但是絕大多數(shù)惡性腫瘤仍然無法從根本上消除，其中轉(zhuǎn)移和復發(fā)是當前腫瘤治療的最主要挑戰(zhàn)。腫瘤干細胞是近年來腫瘤理論研究的熱點之一，它被認為是腫瘤組織內(nèi)真正驅(qū)動腫瘤發(fā)生和發(fā)展的“動力”，同時也是腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。腫瘤干細胞可以很好地解釋腫瘤細胞的異質(zhì)性，由于腫瘤組織中存在腫瘤干細胞群體，而其具有很強的自我更新和分化能力，因而在維持腫瘤的惡性增殖、侵襲、耐藥、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等方面起著決定性的作用。近年來腫瘤干細胞學說受到越來越多的關(guān)注[2-3]，并在白血病、乳腺癌、結(jié)直腸癌、腦腫瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中成功分離出了腫瘤干細胞。除此之外，研究人員還通過基因遺傳譜系追蹤技術(shù)對腫瘤細胞譜系進行了追蹤，發(fā)現(xiàn)并證實了腫瘤干細胞的存在[4-6]。這些研究成果均為基于腫瘤干細胞的腫瘤治療策略提供了理論基礎(chǔ)。

1 腫瘤干細胞模型

腫瘤干細胞模型認為腫瘤干細胞為一群具有干細胞特性的細胞，其可以持續(xù)維持腫瘤的生長，并且腫瘤干細胞與正常的組織干細胞具有很多相似的特性，包括自我更新（對稱和不對稱分裂）和自我分化能力。腫瘤干細胞模型的一個重要應(yīng)用在于它表明腫瘤細胞是分等級的，并且腫瘤干細胞位于等級的頂端。腫瘤干細胞模型的最早證據(jù)來源于急性粒細胞白血病[7]，該文獻表明不同的白血病細胞亞群移植免疫缺陷老鼠后形成腫瘤的能力也是有差異的。其中大多數(shù)白血病細胞不能持續(xù)增殖，而少數(shù)表型為 CD34+CD38–的白血病細胞亞群可在 NOD-SCID 小鼠體內(nèi)引發(fā)新的白血病，首次發(fā)現(xiàn)了白血病干細胞（LSC）的存在。隨后，2003 年，Al-Hajj 等[8]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn) CD44+CD24–的細胞具有腫瘤起始能力。以上兩個研究表明在腫瘤中只有少部分的細胞才有致瘤能力，并且一些瞄準腫瘤常規(guī)細胞的治療并不能真正治愈腫瘤，因為上述治療并不能消除腫瘤干細胞。其他研究采用類似的方法在其他腫瘤類型上進一步提供證據(jù)證實了腫瘤干細胞模型，包括結(jié)直腸癌[9]、胰腺癌[10]、腦腫瘤[11]和卵巢癌[12]。在以上腫瘤模型中，具有致癌能力的群體看起來限制在一小部分表型特異的細胞，而在成瘤實驗中，需要注射很多未分群的細胞才能形成腫瘤，進一步表明成瘤細胞只占少數(shù)。以上研究還提示了大多數(shù)腫瘤都遵循腫瘤干細胞模型并且更有效的腫瘤治療策略應(yīng)該是靶向腫瘤干細胞。近年來，隨著腫瘤學的發(fā)展以及研究的深入，學者們開始發(fā)現(xiàn)有些腫瘤的干細胞并不一定只占少數(shù)，在某些 B 細胞淋巴瘤、T 細胞淋巴瘤和急性髓系白血?。ˋML）中，腫瘤干細胞非常普遍[13]。在 B 細胞急性淋巴母細胞白血病中，至少 50% 的腫瘤細胞可以使野生型受體的老鼠發(fā)病[14]。在一些實體腫瘤中，腫瘤干細胞也可能占大多數(shù)，例如在黑色素腫瘤中，平均 30% 的腫瘤細胞可以形成腫瘤[15]。

2 腫瘤干細胞的起源

目前關(guān)于腫瘤干細胞的來源有多種觀點，至今尚無定論。但普遍認可的有兩種觀點，一種認為腫瘤干細胞來源于正常干細胞，另一種則認為腫瘤干細胞來源于祖細胞。支持腫瘤干細胞來源于干細胞的理由主要有兩點：其一，無限增殖是腫瘤細胞最顯著的特征，顯然已分化細胞缺乏這種能力，而干細胞的自我更新機制已被激活，維持這一活性比在已分化細胞中重新打開這一通路更容易；其二，干細胞較成熟細胞通常維持更長時間，不會在短期內(nèi)死亡，而分化細胞則在細胞周期更新中較快地被新生細胞所替代，這就意味著干細胞相比已分化細胞存在更多累積突變的機會。在一些腫瘤中，學者們通過研究也證實了腫瘤干細胞來源于正常干細胞的突變[16]。另外，還有一些學者認為腫瘤干細胞是在定向祖細胞突變后獲得自我更新能力時發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。例如，通過將 MLL 癌基因轉(zhuǎn)入骨髓祖細胞可以導致急性髓性白血病的產(chǎn)生[17]，還可通過將 MOZ-TIF2 轉(zhuǎn)化進鼠源的造血祖細胞以獲得腫瘤干細胞[18]以及 Kras 突變和 p53 缺失的骨髓祖細胞能夠變成腫瘤干細胞進而在體內(nèi)產(chǎn)生AML[19]。

3 腫瘤干細胞的可塑性

腫瘤干細胞具有一定的可塑性，近幾年的研究表明腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化[20-21]。在體外的細胞培養(yǎng)中，永生化的乳腺上皮細胞（HMECs）在轉(zhuǎn)錄因子 Snail 或者 Twist 的持續(xù)表達以及敲除E-cadherin 或者 TGF-β 的暴露下，HMECs 可以經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）而獲得干細胞的特性[22]，這些細胞具有CD44+CD24–的表型，與乳腺癌干細胞的表型一致。在另一個研究中，研究人員在乳腺癌細胞系中分離出了干性、基底樣或管腔狀表型的細胞群落，而在體外條件下，3 個群落之間可以相互轉(zhuǎn)化[20]。上述研究表明，非腫瘤細胞可以轉(zhuǎn)化為腫瘤干細胞，因此，鑒定以及區(qū)分腫瘤干細胞變得更加困難與復雜，如果轉(zhuǎn)化比例較低，那么仍然能夠采用現(xiàn)有的表面標志物以富集或區(qū)分腫瘤干細胞，如果轉(zhuǎn)化的比例較高，則難以區(qū)分腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞。

另一方面，微環(huán)境也能影響腫瘤干細胞的可塑性，例如在隱窩中的 WNT 配體對維持結(jié)腸癌干細胞的未分化狀態(tài)是非常必要的[23]，而在結(jié)腸癌的起始階段，微環(huán)境中的NF-κB 信號能夠通過引發(fā)脫分化的方式來促進非腫瘤干細胞的腫瘤起始能力[24]。還有研究表明，在腫瘤異種移植試驗中，WNT 信號水平與腫瘤的起始能力密切相關(guān)，位于腫瘤特定微環(huán)境中的成纖維細胞分泌的肝細胞生長因子（HGF）可以提高 WNT 信號水平、細胞的自我更新能力以及使腫瘤干細胞轉(zhuǎn)化為非腫瘤干細胞[25]。

最近在人異種移植瘤開展的細胞敲除研究進一步證實了腫瘤干細胞的可塑性[26-27]，例如利用 CRISPR-Cas9 方法將 caspase9 基因的誘導型（iCasp9）插入到人結(jié)腸癌的LGR5 基因座位時可以誘導腫瘤細胞凋亡，從而減少腫瘤細胞的體積。然而，一旦去除上述誘導物，腫瘤又開始重新生長，并且腫瘤的重新生長與處于有絲分裂靜止的、已分化的腫瘤細胞的增殖密切相關(guān)。譜系追蹤實驗證實了表達KRT20 的已分化腫瘤細胞重新獲得增殖潛能并同時恢復了LGR5+腫瘤干細胞的群落，從而顯露了可塑性的端倪[26]。

4 腫瘤干細胞的代謝

基于氧化磷酸化的代謝對產(chǎn)生足以支持復雜組織運行的能量而言是至關(guān)重要的，通過以上過程還同時伴有活性氧的（ROS）生成，可以導致干細胞功能的紊亂[28]，因而傳統(tǒng)觀點認為干細胞會盡量避免氧化磷酸化而采用糖酵解的方式。代謝異常是腫瘤的一個標志并由此衍生了新的治療策略，大多數(shù)的研究表明與正常組織相似的是，腫瘤也包含不同代謝類型的細胞群落，例如 KRASG12D突變的胰腺癌主要為糖酵解，通過下調(diào) KRASG12D基因的表達可以使大多數(shù)腫瘤消退，然而少部分殘留的腫瘤細胞仍會在 KRASG12D重新表達時介導腫瘤的復發(fā)，這些殘留的腫瘤細胞顯示了腫瘤干細胞的特性并依賴于氧化磷酸化（與大多數(shù)腫瘤細胞的代謝類型不同），進一步利用氧化磷酸化的抑制劑能夠阻斷其復發(fā)[29]。

一系列比較腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞代謝類型的研究結(jié)果顯示兩者并沒有絕對通用的代謝類型，腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞主要采用糖酵解或氧化磷酸化進行代謝，其主要取決于腫瘤細胞的類型以及所用的腫瘤模型[30-31]。另外還有研究表明，腫瘤干細胞或非腫瘤干細胞的代謝類型在特定環(huán)境的刺激下具有可塑性，例如膠質(zhì)瘤干細胞依賴于氧化磷酸化的代謝，但是當氧化代謝被抑制時又可轉(zhuǎn)換為糖酵解的代謝方式[32]。深入的研究表明，EMT 與腫瘤干細胞代謝類型的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)[33-34]。

在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞的代謝適應(yīng)也扮演著非常重要的角色。有研究揭示了器官選擇性地轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞展示出了不同的代謝類型，如選擇性轉(zhuǎn)移至肝臟的腫瘤細胞顯示了谷氨酰胺和氧化磷酸化代謝的減少并同時將通過葡萄糖產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，這種代謝上的適應(yīng)主要通過 HIF-1α 轉(zhuǎn)錄因子來介導[35]，因此腫瘤細胞轉(zhuǎn)換為糖酵解的代謝方式有利于其轉(zhuǎn)移至肝臟。盡管多數(shù)的研究主要關(guān)注腫瘤的葡萄糖代謝，目前有研究報道一些轉(zhuǎn)移分散的腫瘤細胞可以通過脂肪酸來獲取能量，該過程通過在高侵襲性的腫瘤干細胞群落中表達脂肪酸受體 CD36 來實現(xiàn)[36]。

5 腫瘤干細胞與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

表皮樣的腫瘤細胞可以轉(zhuǎn)化為間質(zhì)樣細胞的狀態(tài)以利于轉(zhuǎn)移和侵襲，該過程被稱之為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在過去幾年里，關(guān)于腫瘤干細胞和 EMT 之間的關(guān)系引發(fā)了學者們的廣泛關(guān)注[37-39]。通常而言，過表達 EMT 的轉(zhuǎn)錄因子不僅使細胞的轉(zhuǎn)移能力增強，而且在細胞系中還增加了腫瘤的起始潛能。值得一提的是，腫瘤細胞中 Snai1（EMT 過程中的一個轉(zhuǎn)錄因子）表達水平的升高能夠增強腫瘤起始能力和轉(zhuǎn)移潛能[40]。在乳腺癌中，EMT 誘導下的腫瘤干細胞可以重現(xiàn)正常干細胞的間質(zhì)樣表型。

令人困惑的是許多上皮腫瘤的轉(zhuǎn)移物仍保留表皮樣的構(gòu)造并缺乏間質(zhì)樣細胞的性質(zhì)，該現(xiàn)象可能暗示轉(zhuǎn)移性的腫瘤細胞在到達轉(zhuǎn)移的新環(huán)境時立刻變?yōu)樯掀顟B(tài)[41]或者EMT 在某些環(huán)境下對腫瘤轉(zhuǎn)移并不是必需的，例如上皮樣的腫瘤細胞在不需要采用間質(zhì)樣的細胞狀態(tài)時可以進行轉(zhuǎn)移。為了支持上述觀點，有學者在實驗性的模型中將細胞鎖定在 EMT 狀態(tài)時發(fā)現(xiàn)其幾乎不轉(zhuǎn)移[42]，然而一旦通過敲除 EMT 的誘導者而恢復到上皮狀態(tài)時，轉(zhuǎn)移能力大大增強[43]。實際上，在乳腺癌移植物模型上的活體成像實驗揭示了已經(jīng)歷 EMT 過程的轉(zhuǎn)移性的細胞在到達轉(zhuǎn)移位點時立刻回到上皮細胞的狀態(tài)[44]。另外，有研究表明 EMT 的一個主要誘導因子 Twist1 的不同水平的表達能夠在皮膚癌的鼠源模型中調(diào)節(jié)腫瘤干細胞的特性以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[45]。以上研究結(jié)果與 EMT 對維持腫瘤干細胞特性是必需的理論相沖突，并且暗示在多數(shù)環(huán)境下 EMT 與干性是相脫離的。

另外兩個研究解釋了產(chǎn)生上述差異可能的原因。首先，EMT 在腫瘤細胞中可能是短暫的，因為上皮腫瘤細胞在環(huán)境的刺激下變?yōu)殚g質(zhì)樣類型狀態(tài)是可逆的，這些轉(zhuǎn)換可能導致腫瘤干細胞表型的可塑性，例如在人乳腺癌細胞中非腫瘤干細胞與腫瘤干細胞間的轉(zhuǎn)換主要依賴于 EMT 誘導者ZEB1，非腫瘤干細胞將 ZEB1 基因的啟動子維持在二價染色體構(gòu)象，其使細胞對來自微環(huán)境的 EMT 誘導物快速反應(yīng)，因而提高了它們的腫瘤起始能力[46]。其次，Twist1 的瞬時表達使乳腺細胞趨于腫瘤干細胞狀態(tài)，并且該狀態(tài)在Twist1 活性消失且細胞已回到上皮狀態(tài)后仍然持續(xù)著[47]?？傊?，上述研究表明在許多腫瘤類型中，腫瘤干細胞的等級制度并不是一成不變的。相反，腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞在環(huán)境刺激或隨機狀態(tài)下的相互轉(zhuǎn)換可能是更普遍的生理現(xiàn)象。

6 腫瘤干細胞與腫瘤轉(zhuǎn)移

腫瘤轉(zhuǎn)移需要原位腫瘤細胞的脫落、侵襲血管或淋巴系統(tǒng)、遷移至不同的部位，然后進行細胞增殖并重組新的血管系統(tǒng)，關(guān)于腫瘤干細胞與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系有很多報道，然而目前還沒有研究真正證實在異種移植實驗中具有成瘤能力的細胞在生理條件下同樣具有轉(zhuǎn)移能力。一個根本性的問題在于轉(zhuǎn)移能力是否僅局限于一群具有成瘤能力的細胞或者其起源于多數(shù)腫瘤細胞的基因或表觀遺傳學上的改變而與細胞的成瘤能力無關(guān)。一些研究已經(jīng)表明胰腺癌[48]或結(jié)直腸癌[49]的成瘤細胞同樣具有轉(zhuǎn)移的能力，然而關(guān)于成瘤細胞與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系并沒有進行系統(tǒng)地闡述，比如通過驗證在腫瘤轉(zhuǎn)移循環(huán)以及成瘤中發(fā)揮作用的所有腫瘤細胞。因此，關(guān)于非成瘤腫瘤細胞是否具有與成瘤細胞相似的轉(zhuǎn)移能力以及在原位腫瘤中的非成瘤細胞是否可以在轉(zhuǎn)移至新的環(huán)境時獲得成瘤能力的問題仍需實驗來進一步證實。

2009 年，Kalluri 和 Weinberg[50]通過研究提出了腫瘤細胞可以通過經(jīng)歷 EMT 的過程來獲得轉(zhuǎn)移能力。由于腫瘤細胞失去其表皮細胞的特性（比如細胞間的黏附和極性等）而獲得間質(zhì)細胞的特性，比如遷移、侵襲和抗凋亡等。EMT已被證實是乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的一個必需步驟而且通過在體外誘導 EMT 過程可以使培養(yǎng)的細胞具有與成瘤的乳腺癌細胞相似的 CD44+CD24–的表型[22]。盡管腫瘤干細胞模型以及關(guān)于 EMT 的研究都集中關(guān)注于成瘤細胞和非成瘤細胞兩者在表觀遺傳學上的差異，但是發(fā)生在基因上的不可逆突變也可使細胞具有轉(zhuǎn)移能力，例如在某些類型的胰腺癌或神經(jīng)管細胞瘤中，基因特異性的細胞克隆引發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移[51-52]，這就提出了一個問題：到底是只有腫瘤干細胞能夠通過基因上的改變而獲得轉(zhuǎn)移能力還是非腫瘤干細胞也能通過基因上的改變同時獲得成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力？上述問題仍需通過體內(nèi)的原位腫瘤實驗來證實。

7 腫瘤干細胞與治療抵抗

大多數(shù)的腫瘤治療策略都集中于消除多數(shù)的腫瘤細胞，其中包括標準的抗腫瘤增殖的化療和放療等，然而它們所能帶來的臨床獲益非常有限，往往化療或放療耐受的細胞能夠?qū)е履[瘤的復發(fā)，并且上述耐受的細胞被認為是腫瘤干細胞富集的群落?；熁蚍暖煹牡挚棺畛醣徽J為是正常干細胞和腫瘤干細胞的內(nèi)在特性，其可以通過多個獨立的機制來產(chǎn)生，例如藥物外排泵、DNA 修復能力或抗 ROS 能力的上調(diào)[53-54]。如下討論的，細胞可塑性，特別是腫瘤干細胞進入休眠狀態(tài)的能力已被證實為藥物耐藥的重要機制。

20 世紀 70 年代開展的關(guān)于血液腫瘤的研究工作指出，慢周期性的白血病干細胞能夠?qū)е履[瘤的復發(fā)[55]。研究者們發(fā)現(xiàn)白血病干細胞像多數(shù)正常的干細胞一樣，在化療后就進入細胞周期。而上述關(guān)于標準化療后進入休眠狀態(tài)的腫瘤干細胞引起腫瘤復發(fā)的理論目前進一步在實體腫瘤類型中通過遺傳圖譜的方法得到證實。有研究指出，奧沙利鉑的治療選擇性地支持休眠克隆的生長，并且以上克隆在治療后得到富集[56]；在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的鼠源模型中慢周期性的腫瘤干細胞導致替莫唑胺的耐藥，基因敲除上述細胞群落可以重新使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對化療產(chǎn)生敏感性[57]；TGF-β 信號通路可以驅(qū)動轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細胞進入休眠狀態(tài)。同樣地，TGF-β 信號富集的微環(huán)境能夠在鼠源的鱗狀細胞癌中減慢腫瘤干細胞的增殖并進一步導致順鉑的耐藥，遺傳圖譜分析實驗闡述了以上靜止的腫瘤干細胞在化療結(jié)束后引起腫瘤的復發(fā)[58]。

在人膠質(zhì)瘤模型中，腫瘤干細胞通過采用較慢的增殖狀態(tài)來逃避抗細胞增殖的治療，其主要依賴 Notch 信號通路和 H3K27 脫甲基酶 KDM6A/B 的表觀遺傳修飾[59]。在膀胱癌中，化療激活靜止狀態(tài)的腫瘤干細胞，其反過來導致腫瘤的復發(fā)[60]。在乳腺癌和皮膚癌中，腫瘤干細胞的群落經(jīng)歷 EMT，其不僅與腫瘤遷移密切相關(guān)，而且還與抗增殖藥物的耐藥相關(guān)[58,61]。

還有研究表明，在增殖活躍的組織如胃和腸上化療和放療消除了快速增殖的干細胞和祖細胞，但是富集了處于細胞周期停滯狀態(tài)的分化細胞[62-63]，而如上討論的，這些分化的細胞通過可塑性的方式可以重新取代已消除干細胞的位置。這些研究表明，已分化的腫瘤干細胞后代也可能是化療抵抗細胞的來源，而化療抵抗細胞正是腫瘤復發(fā)的“推動者”。

8 腫瘤干細胞的靶向治療

盡管細胞的可塑性使靶向腫瘤干細胞的治療變得更加困難，但是一些藥物公司已經(jīng)開展了針對消除腫瘤干細胞的治療項目。目前靶向腫瘤干細胞的治療策略主要包括以下幾種[28]：①抑制腫瘤干細胞的關(guān)鍵信號通路，如 WNT、Notch或 Hedgehog 通路；②通過抗體-藥物的偶合物（ADCs）消除腫瘤干細胞，主要靶向腫瘤干細胞的表面標志物，如CD133、LGR5、CD33、DLL3 等；③表觀遺傳學的治療，主要靶向表觀遺傳學的調(diào)節(jié)者，如 LSD1、HDACs、DOT1L、BET 蛋白、IDH1/2、BMI1 等；④靶向休眠狀態(tài)的腫瘤干細胞，主要破壞其特異性的“依賴物”，例如代謝依賴性（如CD36）或 OxPhos 的抑制劑。

9 展望

大量的實驗研究已經(jīng)證實在多種腫瘤類型中存在著腫瘤干細胞，但是我們目前對其的認識還主要基于在異種移植的腫瘤模型上的觀察結(jié)果。利用新的生物技術(shù)，例如CRISPR-Cas9、腫瘤類器官和活體成像等，可以為體內(nèi)原位分析腫瘤干細胞提供新的方式，越來越多的研究開展針對腫瘤干細胞的研究并且不斷地加深對腫瘤干細胞行為和生物學特性的認識，例如腫瘤干細胞并不一定是少數(shù)的、休眠和不可變的群體。另外，腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞之間的相互轉(zhuǎn)化是目前靶向腫瘤干細胞策略中的一個主要挑戰(zhàn)，進一步加深對腫瘤干細胞可塑性的認識將有助于開發(fā)新的針對腫瘤干細胞的治療手段。在臨床應(yīng)用中，由于腫瘤干細胞與正常干細胞具有一定的生物學相似性，因而針對癌癥的治療在消滅腫瘤干細胞的同時又要避免傷害正常的干細胞。同時在急性白血病以及一些實體瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞對常規(guī)癌癥治療手段具有耐受性，因此開展腫瘤干細胞的新的篩選鑒定方法，進一步開發(fā)主要針對腫瘤干細胞的藥物以及治療方法對于癌癥的臨床治療具有重要的意義。