活血化瘀中藥調(diào)控細(xì)胞自噬抗動(dòng)脈粥樣硬化的研究進(jìn)展

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社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高使動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)性心腦血管疾病已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的第一殺手。AS以進(jìn)行性脂質(zhì)沉積、纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，是多種急慢性疾病如冠心病、腦梗死等的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，抗AS研究一直是心血管病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?？笰S研究主要從調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮等方面探討。細(xì)胞水平的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)作為維持膽固醇動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)被逐漸深入研究。研究發(fā)現(xiàn)適度細(xì)胞自噬 促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出而影響RCT過(guò)程[1]，當(dāng)自噬被抑制時(shí)RCT過(guò)程也被終止，證實(shí)細(xì)胞自噬是RCT的關(guān)鍵一環(huán)。另有研究發(fā)現(xiàn)自噬能夠保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定減少其死亡，減少平滑肌細(xì)胞吞噬脂質(zhì)及無(wú)序增殖，能夠通過(guò)多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗AS作用。細(xì)胞自噬在AS研究逐漸深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)自噬能夠通過(guò)參與RCT、抗炎保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制平滑細(xì)胞增殖起到抗AS作用。

1 自噬在AS中的作用

自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、蛋白等大分子物質(zhì)的過(guò)程，在營(yíng)養(yǎng)不良、缺氧、氧化應(yīng)激、DNA損傷等環(huán)境壓力下被激活。機(jī)體可通過(guò)自噬回收利用內(nèi)源性細(xì)胞成分(氨基酸、游離脂肪酸、核苷酸)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[2]。按照細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)入溶酶體途經(jīng)的不同， 自噬可分為3類(lèi)[3]： 微自噬 、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)，通常所說(shuō)的自噬即指巨自噬。典型的自噬始于雙層膜結(jié)構(gòu)的形成，即吞噬泡形成。吞噬泡包裹細(xì)胞內(nèi)需要降解的蛋白聚集體、脂滴及細(xì)胞器，并逐步延伸、成熟，形成自噬體，之后與溶酶體融合形成自噬溶酶體。自噬體外膜與溶酶體膜融合后，溶酶體水解酶降解自噬體內(nèi)膜及底物，生成可被細(xì)胞循環(huán)利用的代謝產(chǎn)物。

既往細(xì)胞自噬多用于腫瘤等相關(guān)研究，近年發(fā)現(xiàn)其與多種心血管病有密切聯(lián)系，包括缺血/再灌注損傷、AS、心律失常、高血壓、心力衰竭等心血管疾病均與之相關(guān)，而AS與自噬的研究也逐年增多并日益深入。AS起始于脂質(zhì)代謝紊亂，內(nèi)皮損傷使脂蛋白浸潤(rùn)血管壁，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，最后平滑肌細(xì)胞增殖、管壁增厚失去彈性。脂質(zhì)負(fù)荷可激活自噬作用，將脂滴運(yùn)往溶酶體接受脂酶的處理，這一過(guò)程動(dòng)員了膽固醇外流，研究發(fā)現(xiàn)抑制巨噬細(xì)胞的溶酶體活性?xún)H影響脂質(zhì)超載細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流出而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響，提示自噬僅在泡沫細(xì)胞的溶酶體降解中發(fā)揮特異性作用。當(dāng)抑制自噬過(guò)程時(shí)膽固醇的外流減少，但破壞溶酶體其他組成時(shí)膽固醇的外流未受影響[1]，這提示自噬是膽固醇流出細(xì)胞的必要過(guò)程，通過(guò)參與RCT可發(fā)揮抗AS作用。

2 自噬相關(guān)通路及蛋白的研究

細(xì)胞自噬主要受以下兩條信號(hào)通路的調(diào)控。①Ⅲ型磷脂酰肌醇-3 激酶 (class Ⅲphosphatidylinositol 3-kinase， class Ⅲ PI3K)/beclin-1 通路的正性調(diào)控：在饑餓、氧化應(yīng)激、缺血等應(yīng)激情況下，Ⅲ型PI3K 通過(guò)與beclin-1 結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜上參與調(diào)控自噬囊泡的形成；②Ⅰ型磷脂酰肌醇-3 激酶(classⅠ phosphatidylinositol 3-kinase， class Ⅰ PI3K)/AKT [又稱(chēng)蛋白激酶B (protein kinase B， PKB)]/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)通路的負(fù)性調(diào)控：在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，該信號(hào)通路處于活化狀態(tài)，進(jìn)而通過(guò)抑制自噬過(guò)程關(guān)鍵蛋白自噬相關(guān)基因1 (autophagy-associated gene 1，ATG1) 而抑制自噬反應(yīng)。在營(yíng)養(yǎng)不良或在mTOR 抑制劑( 如雷帕霉素) 存在的情況下，mTOR活性受抑，ATG1 可形成一個(gè)ATG1 蛋白激酶自噬調(diào)節(jié)復(fù)合物，進(jìn)而啟動(dòng)自噬反應(yīng)[4]。AS發(fā)生于大量脂質(zhì)攝入或脂質(zhì)代謝紊亂情況下，以PI3K/AKT/mTOR通路負(fù)向調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程為主，故這一通路在AS相關(guān)研究中意義較大。

30多種自噬相關(guān)基因(autophagy-associated gene，ATG)編碼的特殊蛋白參與吞噬泡的成熟、延伸，自噬體與溶酶體的融合從而促進(jìn)自噬完成，其中包括Beclin 1、微管相關(guān)蛋白(LC3)-Ⅱ、ATG5-ATG12復(fù)合物等[5]。根據(jù)其在自噬過(guò)程中表現(xiàn)出的功能差異，ATG可分為5類(lèi)： Atg1復(fù)合物[Atg1/ULK1(unc51-like kinase 1)]、Atg9/mAtg9、Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase， PI3K)復(fù)合物、Atg5-Atg12-Atg16L復(fù)合物及Atg8/LC3復(fù)合物。其中與自噬關(guān)系密切，機(jī)制確定的特異蛋白常被用于自噬相關(guān)實(shí)驗(yàn)，如LC3-Ⅱ、Beclin1等。在營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)， 生長(zhǎng)因子激活Ⅰ型PI3K， 從而通過(guò)Akt/PKB(protein kinase B)通路激活哺乳動(dòng)物mTOR?；罨膍TOR抑制了Atg1/ULK1， 從而抑制自噬。而在營(yíng)養(yǎng)不良或mTOR抑制劑(如雷帕霉素)存在的情況下，mTOR受到抑制，ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合體激活并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 誘導(dǎo)自噬發(fā)生。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均證明，mTOR抑制劑能夠減少脂質(zhì)沉積，誘導(dǎo)自噬及巨噬細(xì)胞膽固醇流出[6]。自噬體形成期主要受兩種蛋白系統(tǒng)的調(diào)節(jié)： Atg5-Atg12-Atg16L復(fù)合物和Atg8/LC3復(fù)合物[7]。其中Atg8， 也稱(chēng)為L(zhǎng)C3，LC3前體合成以后，立即被水解為活化的LC3-Ⅰ，并隨后與磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine， PE)結(jié)合形成LC3-Ⅱ。細(xì)胞內(nèi)LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化量可以看作是自噬發(fā)生的依據(jù)，LC3-Ⅱ的相對(duì)量可看作自噬體的含量[8]。Beclin1是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和凋亡機(jī)制的重要分子。它能夠介導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白定位于自噬前體，在自噬過(guò)程中起到關(guān)鍵調(diào)控的作用，Beclin1 表達(dá)缺失或下調(diào)就會(huì)降低細(xì)胞自噬活性。只有在Beclin1-Bcl-2/Bcl-xL復(fù)合體定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)才具有抑制自噬的作用[9]。LC3-Ⅱ及Becilin1可視為自噬的正相關(guān)蛋白，而mTOR則與自噬水平負(fù)相關(guān)。

3 調(diào)控細(xì)胞自噬抗AS的研究現(xiàn)狀

現(xiàn)有關(guān)于自噬與AS的研究以機(jī)制研究為主，通過(guò)特定相關(guān)基因敲除技術(shù)設(shè)計(jì)特定自噬缺陷模型可推出自噬在抗AS中的作用。因巨噬細(xì)胞是細(xì)胞自噬參與抗AS作用最直接的場(chǎng)所，以細(xì)胞自噬為切入點(diǎn)的抗AS研究多以巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象。多項(xiàng)自噬促進(jìn)劑如雷帕霉素等抗AS研究取得成功，一些特異性的蛋白或酶也表現(xiàn)出促進(jìn)自噬抗AS的特性[10-11]，這些酶包括精氨酸酶2、親環(huán)素A等多種蛋白，機(jī)制可涉及mTOR和PRKAA/AMPK信號(hào)通路，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和PI3-激酶通路。在一系列相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)適度在自噬參與抗AS作用中異常重要，自噬能夠促進(jìn)抗炎、膽固醇流出等有益過(guò)程，也能在過(guò)度激活時(shí)因?qū)π募〖?xì)胞損傷而產(chǎn)生負(fù)面作用[12]。

現(xiàn)已證明能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬功能的中藥有姜黃素、白藜蘆醇、熊果酸、木樨草素等[13-16]。白藜蘆醇能夠升高LC3水平，下調(diào)自噬相關(guān)蛋白p62 水平，從而通過(guò)誘導(dǎo)自噬保護(hù)受損巨噬細(xì)胞緩解AS[17]。姜黃素衍生物煙酸姜黃素也是通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR 通路來(lái)激活自噬，提高LC3Ⅱ水平，降低p62 水平，恢復(fù)自噬通量，對(duì)抗氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)造成的不良影響，減少泡沫細(xì)胞形成，減緩AS進(jìn)展[18]?；緸橹兴巻误w成分，鮮有臨床應(yīng)用廣泛的藥物，中藥復(fù)方促自噬抗AS相關(guān)研究則剛剛起步，在體內(nèi)外均證明可以通過(guò)細(xì)胞自噬機(jī)制抗AS的研究未見(jiàn)報(bào)道。已有體外研究證實(shí)益氣活血藥物可參與體外細(xì)胞自噬過(guò)程[19]。另有報(bào)道初步證明搜風(fēng)祛痰中藥可調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白beclin1和LC3從而影響AS斑塊穩(wěn)定性[20]，但研究指標(biāo)過(guò)于單一，未見(jiàn)深入報(bào)道。

4 活血化瘀中藥抗AS機(jī)制研究現(xiàn)狀

中醫(yī)學(xué)中無(wú)AS這一病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)及病理變化，本病多屬于“瘀證”“脈痹”等病證的范疇，病至后期出現(xiàn)相應(yīng)器官病變時(shí)，則可屬于“中風(fēng)”“胸痹”“壞疽”等病證范疇。病因多為膏粱厚味、飲食失節(jié)；易出現(xiàn)病情突變，表現(xiàn)為固定部位疼痛等特點(diǎn)。其病機(jī)主要為“血脈瘀阻”?！端貑?wèn)·痹論篇》云：“痹在于脈……則血凝而不流”，“心痹者，脈不通”，提示“血凝而不流”是AS的主要病機(jī)?；钛鍪侵嗅t(yī)治療AS的有效治法，針對(duì)炎癥反應(yīng)的“毒”認(rèn)識(shí)，解毒活血法治療AS易損斑塊療效確切。臨床及實(shí)驗(yàn)證明，活血化瘀單藥及復(fù)方能夠通過(guò)多種機(jī)制達(dá)到抗AS作用，這些機(jī)制涉及調(diào)脂、抗炎、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)皮、降低血液黏稠度等多個(gè)方面。

單味活血化瘀藥或活血化瘀復(fù)方可以通過(guò)促進(jìn)血液循環(huán)，減小血流阻力，降低血液黏稠度，從而穩(wěn)定并逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈斑塊，發(fā)揮對(duì)AS的防治效果，活血化瘀藥能調(diào)節(jié)血液中脂質(zhì)的代謝，改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。蔣世偉等[21]發(fā)現(xiàn)通脈化濁湯可升高血中高密度脂蛋白(high density lipoprotein， HDL)水平，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能方面表現(xiàn)出良好的療效，證實(shí)了其臨床防治AS的效果。同為活血化瘀代表組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯則通過(guò)改變AS模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)，增強(qiáng)血液流動(dòng)性，抑制凝血因子以降低血液黏稠度，加速代謝來(lái)降低血液中脂質(zhì)水平，起到抗AS的作用?；钛鏊幠軌蚍€(wěn)定或消退動(dòng)脈斑塊[2]。丹蔞片能夠在降低AS兔血脂的同時(shí)，減少單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1)及細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1， ICAM-1)等炎癥因子的表達(dá)水平從而維持斑塊的穩(wěn)定[23]。RCT是外周細(xì)胞，尤其是泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇重新回到肝臟代謝的過(guò)程，能夠減少泡沫細(xì)胞阻止斑塊形成甚至逆轉(zhuǎn)斑塊，是調(diào)節(jié)脂質(zhì)研究的新靶點(diǎn)。丹紅注射液則能夠調(diào)節(jié)RCT相關(guān)蛋白表達(dá)，介導(dǎo)更多的細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，抑制AS斑塊前體的形成，控制斑塊進(jìn)展[24]。

5 芎芍膠囊抗AS研究進(jìn)展及通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬抗AS的研究展望

國(guó)家“八五”攻關(guān)期間，活血化瘀藥血府逐瘀濃縮丸有明確抗AS療效，其后逐漸精簡(jiǎn)選擇方中兩味主藥川芎、赤芍，采用正交設(shè)計(jì)確定劑量配比關(guān)系，提取有效成分(主要是川芎總酚和赤芍總苷)進(jìn)行觀察研究(國(guó)家“十五”科技攻關(guān)項(xiàng)目：No.2001BA701A20)最終形成芎芍膠囊。臨床研究顯示在西藥常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用芎芍膠囊，對(duì)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)術(shù)后再狹窄可以起到較好的防治作用。方中川芎辛溫而燥，善于行走，能化瘀滯，開(kāi)血郁，上行頭目，下達(dá)血海，為血中氣藥。赤芍通利血脈，其性偏涼，可制川芎溫燥之性。川芎與赤芍，性雖有寒熱之殊，而功有行血破滯之同，兩藥合用可發(fā)揮協(xié)同作用使機(jī)體氣血運(yùn)行正常，營(yíng)衛(wèi)生化有度。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其能夠抗血小板黏附聚集，降脂，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，預(yù)防血管重構(gòu)從而延緩AS進(jìn)展。芎芍膠囊能夠促進(jìn)膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，保護(hù)HDL功能，促進(jìn)RCT進(jìn)行最終增加膽固醇流出，抗AS作用確切[25-27]。其中對(duì)親環(huán)素影響巨噬細(xì)胞自噬過(guò)程的體外研究發(fā)現(xiàn)，適度的親環(huán)素濃度才能發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞自噬的作用，這與芎芍膠囊對(duì)AS兔親環(huán)素A的影響研究中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不謀而合[25，28]。

細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞膽固醇流出是RCT的起始關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已發(fā)現(xiàn)芎芍膠囊能夠影響促進(jìn)細(xì)胞自噬過(guò)程相關(guān)蛋白，其是否影響細(xì)胞自噬過(guò)程從而促進(jìn)RCT？針對(duì)這一問(wèn)題以巨噬細(xì)胞自噬作用為切入點(diǎn)，通過(guò)體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，探討芎芍膠囊以巨噬細(xì)胞自噬為作用靶點(diǎn)，揭示其通過(guò)影響細(xì)胞自噬，促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出，參與RCT過(guò)程的抗AS分子機(jī)制，是一項(xiàng)有臨床意義的研究方向，可為中醫(yī)藥防治AS疾病提供新的科學(xué)依據(jù)。