胰腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

陳敏捷 鐘征翔

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)成快速上升趨勢。2014年WHO公布的全球惡性腫瘤統(tǒng)計(jì)資料顯示，胰腺癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第13位，但其病死率卻高居第4位[1]。國內(nèi)的調(diào)查顯示，胰腺癌發(fā)病率位列我國惡性腫瘤的第10位，病死率居第6位[2]。確診胰腺癌的患者1年生存率＜10%，5年生存率＜5%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[3]。隨著手術(shù)、化療、放療技術(shù)進(jìn)步，胰腺癌診治水平有了很大提高，但整體預(yù)后仍未得到明顯改善[4]。胰腺癌患者的預(yù)后不良與術(shù)后短時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]，胰腺癌經(jīng)常經(jīng)血運(yùn)轉(zhuǎn)移至肝臟、肺、骨骼等遠(yuǎn)處器官。因此，早期發(fā)現(xiàn)外周血中是否存在微轉(zhuǎn)移，加強(qiáng)對(duì)胰腺癌復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的監(jiān)測和治療是改善患者預(yù)后的重要手段[6]，但臨床上缺乏高靈感度與特異度的血液指標(biāo)來判斷早期胰腺癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，腹部彩超、CT等影像學(xué)檢查效果也欠佳。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是指自發(fā)或因操作由原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移病灶釋放進(jìn)入外周循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，它可定植在遠(yuǎn)處組織并形成新的轉(zhuǎn)移灶。這些轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞表型和表達(dá)譜與原發(fā)灶相似，因此CTCs作為原發(fā)腫瘤的“液體活檢標(biāo)本”可為實(shí)時(shí)、無創(chuàng)的監(jiān)測腫瘤發(fā)展提供條件。近年來，隨著CTCs富集及鑒定技術(shù)不斷發(fā)展，CTCs在惡性腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移過程中的研究越來越受到重視。研究顯示，CTCs檢測在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中具有早期診斷、檢測復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、制定個(gè)體治療方案及判斷預(yù)后等臨床價(jià)值[7-9]。本文系統(tǒng)地回顧近年來的研究報(bào)道，就CTCs富集、鑒定方法及CTCs檢測在胰腺癌診治中的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 CTCs的富集

CTCs在外周循環(huán)中及其罕見[10]，研究時(shí)通過靈敏的方法濃縮富集CTCs是不可缺少的步驟。目前主要的富集方法有：基于物理學(xué)特征（大小、密度、電荷等）的密度梯度離心法、膜濾過富集法等；基于生物學(xué)特征（細(xì)胞表面蛋白等）的免疫富集法。

1.1 物理學(xué)富集法 密度梯度離心法是基于血液中各種細(xì)胞密度各不同的特點(diǎn)從而分離腫瘤細(xì)胞的一種技術(shù)。其分離的關(guān)鍵是高質(zhì)量的分離介質(zhì)。目前主要的分離介質(zhì)有PtiPrep分離液、Percol分離液、Ficoll分離液及OncoQuick分離液等，其中后兩者較為常用。一項(xiàng)對(duì)比研究顯示，F(xiàn)icoll與OncoQuick富集效率相似，均為70%～90%，但后者的靈敏度較前者有189倍的大幅度提高，單核細(xì)胞去除得以簡化，其特有的滲透性屏障可防止富集后的細(xì)胞移入其他組分[11]。美中不足的是，OncoQuick需要的血液樣本量較大，約15～30ml，總體的靈敏度與特異度仍較低，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。

膜濾過富集法是利用腫瘤細(xì)胞體積大于外周血細(xì)胞的原理建立的分離方法，如ISET分離法、ScreenCell分離法等。Vona等[12]提出的ISET分離技術(shù)通過設(shè)計(jì)濾過膜的孔徑富集CTCs，大多數(shù)研究報(bào)道濾過膜孔徑在8μm大小時(shí)，濾過效果較好。但并非所有的腫瘤細(xì)胞直徑均＞8μm，且血細(xì)胞的直徑也并非均＜8μm，因此該方法特異性較差，易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞丟失與假陽性的發(fā)生。

總體來說上述基于物理學(xué)的CTCs富集方法優(yōu)勢在于操作簡單、方便，成本較低，獲取的腫瘤細(xì)胞保留活力，方便后續(xù)的細(xì)胞形態(tài)觀察和分子生物學(xué)檢測；但這些方法特異度和敏感度均較差，極易出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的丟失，出現(xiàn)假陰性或其他血細(xì)胞及正常人體脫落細(xì)胞的干擾出現(xiàn)假陽性，獲得的腫瘤細(xì)胞純度低，使得應(yīng)用受到限制。

1.2 免疫學(xué)富集法 免疫學(xué)富集法是基于上皮源性的惡性腫瘤均表達(dá)上皮黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和細(xì)胞角蛋白（cytokeratins，CK）等標(biāo)記物的特點(diǎn)，依賴抗原-抗體特異性結(jié)合獲取腫瘤細(xì)胞的方法。其中代表性的方法有：免疫磁珠分選法、CTC-Chip法。

免疫磁珠分選法利用CTCs表面標(biāo)記物EpCAM可與連接有免疫磁性微球的特異性單抗相結(jié)合，形成“抗原-抗體-磁珠”復(fù)合物，在外加磁場作用下吸附復(fù)合物，富集靶細(xì)胞；其包括陰性富集法及陽性富集法。目前應(yīng)用范圍較廣的CTCs富集方法，如免疫磁性細(xì)胞分選儀(MACS)、CellSearch系統(tǒng)和AdnaTest癌細(xì)胞檢測系統(tǒng)等均基于此法。其中CellSearch是唯一通過美國FDA批準(zhǔn)用于臨床乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌的CTCs檢測與分析的系統(tǒng)[13]，運(yùn)用該系統(tǒng)在胰腺癌CTCs研究中也取得了一定進(jìn)展[14-15]。

CTC-Chip法技術(shù)是居于微流體芯片的基礎(chǔ)上，在微流通道表面包覆了78 000個(gè)EpCAM抗體位點(diǎn)，在血液樣本進(jìn)入芯片后，通道表面抗體通過抗原-抗體反應(yīng)捕獲CTCs。Nagrath等[16]用CTC-Chip檢測15例胰腺癌患者均發(fā)現(xiàn)CTCs，數(shù)量在9～831個(gè)不等。第二代CTCChip芯片又稱為幾何增強(qiáng)混合芯片（GEM-Chip），其在一代芯片的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一種小室流動(dòng)槽，可使樣品流體快速混合，顯著提高捕獲細(xì)胞的數(shù)量，研究人員還在血液樣本中捕捉到4～12個(gè)CTCs群，這是其他CTCs分離方法從未報(bào)道過的[17]。為進(jìn)一步檢測研究腫瘤細(xì)胞群，研究團(tuán)隊(duì)據(jù)此研發(fā)出一種用于捕捉2個(gè)或2個(gè)以上CTCs組成細(xì)胞群的最新微流體裝置，名為Cluster-Chip，他們使用Cluster-Chip發(fā)現(xiàn)30%～40%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌及黑色素瘤患者存在腫瘤細(xì)胞群，并通過RNA序列證實(shí)了它們的腫瘤起源[18]。這使其可能成為檢測腫瘤細(xì)胞群特性、發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞、研究腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的新方法。

免疫學(xué)富集法使CTCs保留了細(xì)胞的完整性，靈敏度與特異度較高，所需血液樣本量也較少，易于重復(fù)測定。但CTCs存在異質(zhì)性，且腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)化、演變及上皮間質(zhì)化（EMT）過程中可能會(huì)丟失其表面抗原，因此該方法可能會(huì)導(dǎo)致CTCs的遺漏，產(chǎn)生假陰性。

2 CTCs的鑒定

目前的分離技術(shù)無法百分百的富集CTCs，仍有部分血細(xì)胞會(huì)混雜在樣本當(dāng)中，因此有效的CTCs鑒定技術(shù)顯得格外重要。CTCs鑒定主要是通過檢測腫瘤細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物、分泌蛋白及基因等確定腫瘤細(xì)胞。常用的CTCs檢測技術(shù)有：細(xì)胞化學(xué)染色檢測法、核酸檢測法、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法（ICC）、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）及酶聯(lián)免疫分析技術(shù)（EPISPOT）等。

2.1 細(xì)胞化學(xué)染色檢測法 細(xì)胞化學(xué)染色檢測CTCs是基于細(xì)胞內(nèi)的酸堿性物質(zhì)能與相應(yīng)的堿或酸性染料結(jié)合，顯示出現(xiàn)不同顏色的原理，包括瑞士染色、吉姆薩染色、蘇木精-伊紅（HE）染色等。有研究對(duì)179例胰腺病變的患者利用吉姆薩染色方法檢測CTCs，發(fā)現(xiàn)除胰腺癌患者外周血存在異形細(xì)胞外，在其他胰腺病變患者的外周血中均能找到類似的異形細(xì)胞，且這些異形細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞較難鑒別[19]。細(xì)胞化學(xué)染色檢測法操作簡單，成本較低，但單從形態(tài)學(xué)鑒定腫瘤細(xì)胞較為困難，易受血液中炎癥細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞及病理科醫(yī)生水平等干擾，且腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤細(xì)胞脫落及在外周血中轉(zhuǎn)化演變過程中可能存在形態(tài)學(xué)的改變，這使其應(yīng)用受到限制。

2.2 ICC ICC的基本原理是抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，利用單克隆抗體與特異的腫瘤標(biāo)志物結(jié)合，通過酶與底物反應(yīng)顯色來判斷腫瘤細(xì)胞，能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行定量、定性分析，是CTCs鑒定中應(yīng)用最廣的技術(shù)之一。CellSearch系統(tǒng)的CTCs鑒定部分基于此法，它利用經(jīng)典的 CK8/18/19、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、CD45 標(biāo)志物組合對(duì)富集樣本進(jìn)行檢測，將 CK8/18/19（+）、DAPI（+）、CD45（-）的定義為腫瘤細(xì)胞[20]。目前ICC已在胰腺癌CTCs中廣泛使用，較為常見的腫瘤標(biāo)志物有：EpCAM、CK、CA19-9、波形蛋白（Vimentin）等[21-25]。ICC 鑒定 CTCs受人為因素干擾較少，多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測有效地提高了該方法的靈敏度與特異度。但由于一些良性上皮增殖性疾病、手術(shù)、炎癥和組織創(chuàng)傷均可導(dǎo)致上皮細(xì)胞進(jìn)入外周血，這些細(xì)胞表面存在同樣上皮特異性抗原，易導(dǎo)致假陽性的發(fā)生；同時(shí)在腫瘤EMT及轉(zhuǎn)化演變過程中，CTCs表面特異性標(biāo)志物減弱甚至丟失，導(dǎo)致假陰性的發(fā)生。隨著對(duì)CTCs異質(zhì)性的進(jìn)一步研究，特異性腫瘤免疫標(biāo)志物的出現(xiàn)，該方法在CTCs鑒定中必有廣闊的前景。

流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）是一項(xiàng)以細(xì)胞熒光化學(xué)及單克隆抗體技術(shù)為基礎(chǔ)，集激光、電子物理、光電測量、計(jì)算機(jī)為一體的新型技術(shù)。其可以定量計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞數(shù)量，檢測數(shù)據(jù)較精確，還可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析。但其檢測成本較高，且FCM檢測靶細(xì)胞的靈敏度為1/1～10萬，但外周血中CTCs數(shù)量常＜1/100萬，故CTCs數(shù)量一定程度上限制了FCM在此領(lǐng)域的應(yīng)用[26]。近年來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了許多改良技術(shù)，如光纖陣列掃描技術(shù)（FAST）、鐳射掃描細(xì)胞技術(shù)（LSC）、自動(dòng)細(xì)胞顯像系統(tǒng)（ACIS）等大大提高了免疫熒光鑒定效率。Hsieh等[27]利用FAST對(duì)3份加入10～21個(gè)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的血液標(biāo)本進(jìn)行檢測，靈敏度達(dá)到98%。

2.3 核酸檢測法 通過檢測腫瘤細(xì)胞的特異性遺傳物質(zhì)來鑒定CTCs存在，如原癌基因、抑癌基因突變、染色體重排、微衛(wèi)星不穩(wěn)定及致瘤病毒序列等。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。癌基因的表達(dá)增加和突變?cè)谠S多腫瘤早期和良性的階段就可出現(xiàn)，PCR技術(shù)不但能有效地檢測基因的突變，而且能準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。但因大多數(shù)實(shí)體腫瘤DNA變化不明顯，且游離DNA不能明確就是腫瘤細(xì)胞來源，所以PCR檢測CTCs有待進(jìn)一步研究。

逆轉(zhuǎn)錄-集合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是在PCR的基礎(chǔ)上擴(kuò)增有腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片段的方法，它可識(shí)別腫瘤細(xì)胞特異性的mRNA。該技術(shù)靈敏度高，可在107～108個(gè)外周血單核細(xì)胞中檢測出單個(gè)腫瘤細(xì)胞，但是由于核酸起源不明確，RT-PCR檢測CTCs時(shí)，結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)假陽性，影響檢測的特異性。為提高檢測的特異度和靈敏度，研究者使用免疫磁珠與RT-PCR 聯(lián)合多個(gè) mRNA（hTERT、C-MET、CK-20及CEA）鑒定CTCs，陽性率顯著提高[28]。近年來，實(shí)時(shí)定量探針-PCR（QPCR），熒光定量-PCR（FQPCR）、巢式定量-PCR等新方法的出現(xiàn)，顯著提高了擴(kuò)增效率和檢測靈敏度，目前應(yīng)用較廣泛，是檢測鑒定CTCs的有效手段。

2.4 FISH FISH是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號(hào)，來確定與特異探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細(xì)胞器中的定位。Zhang等[29]依靠免疫磁珠富集胰腺癌CTCs后聯(lián)合CK、CD45、DAPI熒光染色及CEP8熒光探針法鑒定CTCs，其將CK+CD45-DAPI+CEP8=2，CK+CD45-DAPI+CEP8＞2 和 CK-CD45-DAPI+CEP8＞2定義為CTCs，診斷胰腺癌的靈敏度為68.18%，特異度為94.87%。FISH在CTCs診斷上特異性較高，但其檢測成本較高，探針設(shè)計(jì)不合理，環(huán)境樣品干擾等可能導(dǎo)致假陽性的發(fā)生。

2.5 EPISPOT EPISPOT是另一種基于檢測腫瘤細(xì)胞分泌的特異性標(biāo)志蛋白的免疫方法。在該技術(shù)中，細(xì)胞分泌蛋白直接與載破片上特定熒光抗體結(jié)合，檢測CTCs的存在。通過檢測 CK19、Her2、MUC1、ERFR 等位點(diǎn)，已在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中得到應(yīng)用[30-31]。此法可以驗(yàn)證CTCs的活性，還能檢測腫瘤形成的分泌蛋白，對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究具有重要的意義。但該法檢測靈敏度低，無法估計(jì)CTCs的數(shù)量，應(yīng)用于CTCs檢測的可行性還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

3 CTCs檢測在胰腺癌診治中的應(yīng)用

3.1 CTCs檢測在胰腺癌診斷中的應(yīng)用 目前臨床上缺乏有效的血液標(biāo)準(zhǔn)判斷早期胰腺癌，腹部彩超、CT等影像學(xué)檢查效果欠佳。研究顯示，在腫瘤形成早期癌細(xì)胞就可以從原發(fā)灶脫落或經(jīng)EMT進(jìn)入外周血[32]，因此作為“液體活檢”檢測CTCs可能可以提高腫瘤早期的診斷效率，甚至監(jiān)測癌前病變預(yù)測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。劉艷輝等[33]采用免疫磁珠結(jié)合免疫熒光方法對(duì)胰腺癌患者進(jìn)行檢測，CTCs的檢測率為88.41%，且CTCs的檢出情況和血清CA19-9升高水平具有相關(guān)性，認(rèn)為CTCs檢測可提高胰腺癌的診斷率。Rhim等[34]在胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液腫瘤（IPMN）中也成功檢測出CTCs，并指出CTCs是可預(yù)測胰腺癌的診斷指標(biāo)。Kurihara等[35]在胰腺癌與腫瘤分期的研究中顯示隨著腫瘤分期升高，CTCs檢測率和數(shù)目逐漸升高，推斷CTCs能成為腫瘤分期中一項(xiàng)重要的參考數(shù)據(jù)。

3.2 CTCs在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用 手術(shù)切除是早期胰腺癌的主要治療手段，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是手術(shù)治療失敗的主要原因，也是影響患者生存期的重要因素，監(jiān)測腫瘤術(shù)后早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成臨床亟待解決的問題。在一項(xiàng)乳腺癌的研究中表明，CTCs檢測有助于早期微轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的診斷，尤其是對(duì)那些腫瘤較小，在影像學(xué)不能清晰顯示的微轉(zhuǎn)移瘤有重要臨床價(jià)值。Tanaka等[36]檢測肺癌CTCs，分析發(fā)現(xiàn)CTCs水平與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，發(fā)生轉(zhuǎn)移者CTCs數(shù)目增多，其檢測率的敏感性及特異性分別為71%和83%。張建偉等[37]利用免疫磁珠結(jié)合免疫熒光檢測83例胰腺癌手術(shù)患者CTCs，結(jié)果顯示CTCs數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性（P=0.027，logistic回歸分析）。CTCs與胰腺癌早期微轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 CTCs檢測在指導(dǎo)胰腺癌化療中的應(yīng)用 化療是胰腺癌除手術(shù)之外的主要治療手段之一，但化療患者生存率仍＜5%[38]。在化療前后監(jiān)測CTCs變化可進(jìn)一步揭示腫瘤對(duì)化療藥物的抗藥性并預(yù)測化療效果[39]。Torphy等[40]建立胰腺導(dǎo)管腺癌小鼠模型，隨機(jī)分為化療組與空白組，計(jì)數(shù)治療前后CTCs變化，化療組接受治療后CTCs數(shù)量明顯減少（26.61 vs 2.21，P=0.0207）。Ren等[25]對(duì)41例胰腺癌患者在接受5-氟尿嘧啶治療前后利用免疫熒光法進(jìn)行了CTCs檢測發(fā)現(xiàn)，治療前有33例患者CTCs＞2個(gè)，在接受治療1周后這項(xiàng)數(shù)據(jù)減少到13例，這表明CTCs檢測可作為檢測藥效的指標(biāo)。

目前根據(jù)胰腺癌患者組織學(xué)活檢特點(diǎn)，針對(duì)腫瘤細(xì)胞與腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路的個(gè)體化治療備受關(guān)注。針對(duì)表皮生長因子受體（EGFR）的靶向治療藥物埃羅替尼（Erlotinib）已被美國FDA批準(zhǔn)與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用于胰腺癌一線治療的靶向治療藥物[41]。Toubaji等[42]對(duì)5例KRAS基因突變的胰腺癌患者相應(yīng)的予以KRAS蛋白疫苗，結(jié)果顯示無進(jìn)展生存期（PFS）為35.2個(gè)月，總生存期（OS）為44.4個(gè)月。除此之外針對(duì)胰腺癌鋅指蛋白217（ZNF217）、Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通入等的研究也取得一定進(jìn)展[43-44]。但由于藥物的使用、腫瘤的演變，可能使腫瘤基因型發(fā)生改變，無法定期獲取組織標(biāo)本，使個(gè)體化用藥在一定程度上受到限制，而CTCs作為兩者之間的橋梁，能同時(shí)反映原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的性質(zhì)[45]，其在個(gè)體化治療中有廣泛的應(yīng)用前景。

3.4 CTCs在評(píng)估胰腺癌預(yù)后中的應(yīng)用 胰腺癌進(jìn)展快、預(yù)后差，但目前尚無有效評(píng)估其預(yù)后的指標(biāo)。De Albuquerque等[46]利用免疫磁珠富集法聯(lián)合RT-PCR檢測34例胰腺癌患者外周血CTCs,并分析CTCs與PFS的相關(guān)性，CTCs陽性的16例患者PFS中位數(shù)為66d，CTCs陰性的患者PFS中位數(shù)為138d，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）。Han等[47]對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)庫623例胰腺癌患者進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)268例CTCs陽性，355例CTCs陰性，CTCs陽性組的PFS及OS較短。Chang等[48]通過微流控芯片聯(lián)合免疫熒光檢測63例胰腺癌患者循環(huán)微癌栓（CTM），其中51例檢測出CTM，在CTM與OS及PFS的相關(guān)性研究中顯示，CTM陽性患者對(duì)比CTM陰性的患者 OS（6.4 月 vs 19.8 月，P＜0.0001）及 PFS（2.7月vs 12.1月，P＜0.0001）較短。上述研究結(jié)果基本一致，外周血CTCs數(shù)量與胰腺癌PFS及OS顯著相關(guān)，提示CTCs可作為判斷胰腺癌患者預(yù)后的檢測標(biāo)志物。但研究人員也指出小樣本單變量的CTCs檢測預(yù)測胰腺癌預(yù)后并無多大的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[49]，因此CTCs臨床應(yīng)用價(jià)值仍需多中心、大樣本的研究加以確認(rèn)。

4 小結(jié)

綜上所述，CTCs檢測在胰腺癌診治中具有廣闊的前景，探索分析CTCs對(duì)臨床研究胰腺癌意義重大。但目前的CTCs檢測尚處于科研階段，臨床應(yīng)用還存在諸多問題，如（1）胰腺癌CTCs的富集方法較多，無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同方法的富集效率參差不齊；（2）與乳腺癌、肺癌相比，胰腺癌缺乏特異性的腫瘤標(biāo)志物，限制了CTCs的臨床檢測；（3）CTCs數(shù)量在胰腺癌的診斷、判斷轉(zhuǎn)移、分析預(yù)后中無定論，仍需要大規(guī)模多中心的研究；（4）對(duì)于早期CTCs陽性的患者如何進(jìn)行下一步診治仍需進(jìn)一步探索；（5）胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的研究尚處于瓶頸階段；（6）痕量的CTCs體外培養(yǎng)可行性還需進(jìn)一步研究；（7）基于胰腺癌CTCs的分子靶向治療還有待進(jìn)一步開發(fā)研究。因此，在進(jìn)一步改善方法學(xué)研究胰腺癌CTCs數(shù)量與臨床關(guān)系的同時(shí)，關(guān)注CTCs本身的基因表型，探索CTCs異質(zhì)性將會(huì)是未來研究的重點(diǎn)。

相信隨著現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)胰腺癌CTCs的研究不斷深入，作為可替代侵入性組織活檢的“液體活檢”，CTCs檢測將為胰腺癌的早期診斷、監(jiān)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、制定個(gè)體治療方案及判斷預(yù)后等提供新思路。

[1]Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics,2014[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2014,64(1):9-29.

[2]He Y,Zheng R,Li D,et al.Pancreatic cancer incidence and mortality patterns in China,2011[J].Chin J Cancer Res,2015,27(1):29-37.

[3]Wolfgang CL,Herman JM,Laheru DA,et al.Recent progress in pancreatic cancer[J].CA Cancer J Clin,2013,63(5):318-348.

[4]Bayraktar S.Recent developments in palliative chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreas cancer[J].World Journal of Gastroenterology,2010,16(6):673.

[5]David M,Lepage C,Jouve JL,et al.Management and prognosis of pancreatic cancer over a 30-year period[J].Br J Cancer,2009,101(2):215-218.

[6]Kondo N,Murakami Y,Uemura K,et al.Prognostic Impact of Perioperative Serum CA 19-9 Levels in Patients with Resectable Pancreatic Cancer[J].Annals of Surgical Oncology,2010,17(9):2321-2329.

[7]Marrinucci D,Bethel K,Kolatkar A,et al.Fluid biopsy in patients with metastatic prostate,pancreatic and breast cancers[J].Phys Biol,2012,9(1):16003.

[8]Liu Y,Yuan D,Ye W,et al.Prognostic value of circulating endothelial cells in non-small cell lung cancer patients:a systematic review and meta-analysis[J].Transl Lung Cancer Res,2015,4(5):610-618.

[9]Gao P,Jiao SC,Bai L,et al.Detection of circulating tumour cells in gastric and hepatocellular carcinoma:A systematic review[J].Journal of International Medical Research,2013,41(4):923-933.

[10]Paterlini-Brechot P,Benali NL.Circulating tumor cells(CTC)detection:Clinical impact and future directions[J].Cancer Letters,2007,253(2):180-204.

[11]Rosenberg R,Gertler R,Friederichs J,et al.Comparison of two density gradient centrifugation systems for the enrichment of disseminated tu-mor cells in blood[J].Cytometry,2002,49(4):150.

[12]Vona G,Sabile A,Louha M,et al.Isolation by size of epithelial tumor cells:a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells[J].Am J Pathol,2000,156(1):57-63.

[13]Miller MC,Doyle GV,Terstappen LWMM.Significance of Circulating Tumor Cells Detected by the CellSearch System in Patients with Metastatic Breast Colorectal and Prostate Cancer[J].Journal of Oncology,2010,2010:1-8.

[14]Khoja L,Backen A,Sloane R,et al.A pilot study to explore circulating tumour cells in pancreatic cancer as a novel biomarker[J].Br J Cancer,2012,106(3):508-516.

[15]Bobek V.Circulating tumor cells in pancreatic cancer patients:Enrichment and cultivation[J].World Journal of Gastroenterology,2014,20(45):17163.

[16]Nagrath S,Sequist LV,Maheswaran S,et al.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology[J].Nature,2007,450(7173):1235-1239.

[17]Stott SL,Hsu CH,Tsukrov DI,et al.Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip[J].Proceedings of the National Academyof Sciences,2010,107(43):18392-18397.

[18]Sarioglu AF,Aceto N,Kojic N,et al.A microfluidic device for label-free,physical capture of circulating tumor cell clusters[J].Nature Methods,2015,12(7):685-691.

[19]CauleyCE,Pitman MB,Zhou J,et al.Circulating Epithelial Cells in Patients with Pancreatic Lesions:Clinical and Pathologic Findings[J].Journal of the American College of Surgeons,2015,221(3):699-707.

[20]Kraan J,Sleijfer S,Strijbos MH,et al.External quality assurance of circulating tumor cell enumeration using the CellSearch?system:A feasibility study[J].Cytometry Part B:Clinical Cytometry,2011,80B(2):112-118.

[21]Kulemann B,Liss AS,Warshaw AL,et al.KRAS mutations in pancreatic circulating tumor cells:a pilot study[J].Tumor Biology,2015,37(6):1-8.

[22]Kamande JW,Hupert ML,Witek MA,et al.Modular Microsystem for the Isolation,Enumeration,and Phenotyping of Circulating Tumor Cells in Patients with Pancreatic Cancer[J].Analytical Chemistry,2013,85(19):9092-9100.

[23]Poruk KE,Saunders T,Blackford AL,et al.Circulating Tumor Cell Phenotype Predicts Recurrence and Survival in Pancreatic Adenocarcinoma[J].Annals of Surgery,2016,264(6):1073.

[24]Zhang J,Li S,Liu F,et al.SELEX Aptamer Used as a Probe to Detect Circulating Tumor Cells in Peripheral Blood of Pancreatic Cancer Patients[J].Plos ONE,2015,10(3):e121920.

[25]Ren C,Han C,Zhang J,et al.Detection of apoptotic circulating tumor cells in advanced pancreatic cancer following 5-fluorouracil chemotherapy[J].Cancer Biology&Therapy,2014,12(8):700-706.

[26]Goodale D,Phay C,Postenka CO,et al.Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry[J].Cytometry A,2009,75(4):344-355.

[27]Hsieh H B,Marrinucci D,Bethel K,et al.High speed detection of circulating tumor cells[J].Biosensors&Bioelectronics,2006,21(10):1893-1899.

[28]Zhou J,Hu L,Yu Z,et al.Marker expression in circulating cancer cells of pancreatic cancer patients[J].J Surg Res,2011,171(2):631-636.

[29]Zhang Y,Wang F,Ning N,et al.Patterns of circulating tumor cells identified by CEP8,CK and CD45 in pancreatic cancer[J].Int J Cancer,2015,136(5):1228-1233.

[30]Alix-Panabieres C,Pantel K.Liquid biopsy in cancer patients:advances in capturing viable CTCs for functional studies using the EPISPOT assay[J].ExpertRevMolDiagn,2015,15(11):1411-1417.

[31]Ramirez JM,Fehm T,Orsini M,et al.Prognostic Relevance of Viable Circulating Tumor Cells Detected by EPISPOT in Metastatic Breast Cancer Patients[J].Clinical Chemistry,2013,60(1):214-221.

[32]Serrano MJ,Rovira PS,Martinez-Zubiaurre I,et al.Dynamics of circulating tumor cells in early breast cancer under neoadjuvant therapy[J].Exp Ther Med,2012,4(1):43-48.

[33]劉艷輝,唐甜甜,孫麗麗.腫瘤外周血循環(huán)細(xì)胞對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013(10):1045-1047.

[34]Rhim AD,Thege FI,Santana SM,et al.Detection of Circulating Pancreas Epithelial Cells in Patients With Pancreatic Cystic Lesions[J].Gastroenterology,2014,146(3):647-651.

[35]Kurihara T,Itoi T,Sofuni A,et al.Detection of circulating tumor cells in patients with pancreatic cancer:a preliminary result[J].Journal of Hepato-Biliary-PancreaticSurgery,2008,15(2):189-195.

[36]Tanaka F,Yoneda K,Kondo N,et al.Circulating tumor cell as a diagnostic marker in primary lung cancer[J].Clin Cancer Res,2009,15(22):6980-6986.

[37]張建偉,許陽,李潛,等.胰腺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤病理和預(yù)后的關(guān)系[J].中國醫(yī)刊,2014(4):35-39.

[38]Arora S,Bhardwaj A,Singh S,et al.Abstract 4794:An undesired effect of chemotherapy:gemcitabine promotes pancreatic cancer cell invasiveness through upregulation of CXCR4[J].Cancer Research,2013,73(8 Supplement):4794-4794.

[39]Thalgott M,Rack B,Eiber M,et al.Categorical versus continuous circulating tumor cell enumeration as early surrogate marker for therapy response and prognosis during docetaxel therapy in metastatic prostate cancer patients[J].Bmc Cancer,2015,15(1):458.

[40]Torphy RJ,Tignanelli CJ,Kamande JW,et al.Circulating tumor cells as a biomarker of response to treatment in patient-derived xenograft mouse models of pancreatic adenocarcinoma[J].PLoS One,2014,9(2):e89474.

[41]Moore MJ,Goldstein D,Hamm J,et al.Erlotinib Plus Gemcitabine Compared With Gemcitabine Alone in Patients With Advanced Pancreatic Cancer:A Phase III Trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group [J].Journal of Clinical Oncology,2007,25(15):1960-1966.

[42]Toubaji A,Achtar M,Provenzano M,et al.Pilot study of mutant ras peptide-based vaccine as an adjuvant treatment in pancreatic and colorectalcancers[J].CancerImmunology,Immunotherapy,2008,57(9):1413-1420.

[43]季婷婷,譚擎纓,潘升華,等.鋅指蛋白217在胰腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].中華內(nèi)分泌外科雜志,2014(6):475-478.

[44]Rucki AA.Pancreatic cancer stroma:Understanding biology leads to new therapeutic strategies[J].World Journal of Gastroenterology,2014,20(9):2237.

[45]Cristofanilli M,Mendelsohn J.Circulating tumor cells in breast cancer:Advanced tools for"tailored"therapy?[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(46):17073-17074.

[46]de Albuquerque A,Kubisch I,Breier G,et al.Multimarker Gene Analysis of Circulating Tumor Cells in Pancreatic Cancer Patients:A FeasibilityStudy[J].Oncology,2012,82(1):3-10.

[47]Han L,Chen W,Zhao Q.Prognostic value of circulating tumor cells in patients with pancreatic cancer:a meta-analysis[J].Tumor Biology,2014,35(3):2473-2480.

[48]Chang MC,Chang YT,Chen JY,et al.Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma[J].Clinical Chemistry,2016,62(3):505-513.

[49]Bidard FC,Huguet F,Louvet C,et al.Circulating tumor cells in locally advanced pancreatic adenocarcinoma:the ancillary CirCe 07 study to the LAP 07 trial[J].Annals of Oncology,2013,24(8):2057-2061.