PD-L1作為PD-1靶向藥物治療非小細胞肺癌療效預測生物標志的意義及其局限性

魏雨晴，呂鏜烽，劉紅兵，宋 勇

（南京大學醫(yī)學院臨床學院，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，南京大學呼吸病學研究所，南京210002）

0 引言

肺癌是導致人類癌性死亡的首要疾病，肺癌的發(fā)生率和死亡率居男性癌癥的第一位，在女性癌癥患者中發(fā)生率位居第四，死亡率位居第二［1］。肺癌分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cance，SCLC）兩大類型，其中NSCLC患者比例約為85%，約80%的患者被確診為肺癌時已處于晚期［2］。含鉑兩藥化療方案是大多數(shù)晚期無基因突變非小細胞肺癌患者的標準治療方案，患者的中位生存期約為10個月［3］，而對于一些敏感基因突變的患者，靶向療法已成為其標準治療方案（如EGFR基因突變的患者，靶向EGFR-TKIs治療中位總生存率約為20個月）［4-5］。進展期及轉移性肺癌的預后極差，5年預后生存率僅為15%左右［6］。近兩年來，以PD-1／PD-L1為主的免疫檢查點抑制劑藥物的研究與應用迅速興起，PD-L1蛋白與免疫細胞受體PD-1結合形成類似汽車剎車的作用，可降低T細胞的免疫功能從而使腫瘤發(fā)生免疫逃逸［7］，拮抗PD-1與PD-L1之間的結合，阻斷負向調(diào)控信號，則可以增強機體內(nèi)源性的抗腫瘤免疫效應。腫瘤的PD-L1表達水平作為可能的潛在預測生物標志物備受矚目。PD-L1（又稱B7-H1，CD274）屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，臨床數(shù)據(jù)［8］表明PD-L1在胃癌、肝細胞癌、腎細胞癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌及膀胱癌中過表達提示預后不良，在乳腺癌及默克爾細胞癌中有著很好的臨床預后，而在肺癌、結直腸癌及黑色素瘤中的預后價值仍有爭議，有些患者PD-L1低表達卻仍對PD-1／PD-L1通路抑制劑應答有效。因此如何有效地選擇合適的患者進行治療十分重要，尤其是如何尋找PD-L1陽性的最佳cut-off值。現(xiàn)本文將對PD-L1作為NSCLC預測生物標志物的意義及其局限性作出如下綜述。

1 PD-1／PD-L1信號通路的生物學特征

機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視與排斥功能在清除惡性腫瘤細胞中起著極其重要的作用，可通過識別腫瘤特異性抗原，產(chǎn)生T細胞免疫應答從而清除腫瘤細胞［9］。到目前為止，已經(jīng)提出有多種機制導致無效的抗腫瘤免疫：抗原提呈機制的下調(diào)、免疫編輯、自身免疫耐受的產(chǎn)生以及腫瘤微環(huán)境中免疫檢查點的上調(diào)［10］。2012年anti-PD-1抗體首次臨床實驗結果發(fā)表，并完善了PD-1／PD-L1途徑的腫瘤免疫調(diào)節(jié)機制：介導腫瘤局部的獲得性免疫逃逸［11］。PD-1是屬于CD28免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一種負性共刺激分子，通常以單體的形式表達于激活的CD4+／CD8+T細胞、B細胞、自然殺傷T細胞、單核細胞和樹突狀細胞表面。PD-1有兩個配體：PD-L1和PD-L2，均為含IgC和IgV胞外結構域的Ⅰ型跨膜糖蛋白，具有40%的氨基酸同源性［12］。 PD-L1（B7-H1）是 PD-1 最主要的配體，屬于B7超家族，在免疫細胞（如腫瘤浸潤淋巴細胞）和上皮細胞（如腫瘤細胞）表面誘導性表達［13-14］。PD-L1在正常組織中幾乎不表達，卻能誘導性地表達于腫瘤組織［15］，而這也正是PD-L1通路與其他共抑制信號通路的不同之處，研究［8］表明腫瘤患者選擇性表達PD-L1與其臨床預后有一定的關聯(lián)。

2 PD-L1在NSCLC組織中的表達及相關性分析

2015年10月，美國FDA批準用兩種不同的免疫組織化學（Immunohistochemical，IHC）方法測定被福爾馬林固定及石蠟包埋的NSCLC組織中的PD-L1的表達，分別是Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx和Dako PD-L1 IHC 28-8 pharmDx，這兩種檢測方法相應與Pembrolizumab（Keytruda，默沙東）、Nivolumab（Opdivo，BMS）相結合［16］。下面主要通過介紹3個大型臨床研究來分析NSCLC患者PD-L1的表達。

2．1 KEYNOTE-001 研究 KEYNOTE-001 研究［17］是一項大型的國際Ⅰ期臨床試驗，其評估了PD-1檢查點抑制劑Pembrolizumab治療晚期NSCLC的安全性和有效性，同時確定和證實腫瘤PD-L1表達水平與Pembrolizumab治療獲益相關。該研究共納入101名年齡≥18歲的無 EGFR／ALK突變的Ⅳ期 NSCLC患者，應用抗PD-L1抗體克隆22C3和原型免疫組化分析來判定 PD-L1狀態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)：27名患者的TPS≥50%，52名患者的TPS為1%～49%，12名患者的TPS＜1%；客觀緩解率為27%，中位總生存期為22．1個月；PD-L1 TPS≥50% 的患者客觀緩解率（objective response rate，ORR），12個月無進展生存期（progression-free survival，PFS）以及12個月總體生存期（overall survival， OS）分別為 51．9%、54%、85%，較整體水平明顯提高（分別為26．7%、35%、71%），僅有12名患者（11．9%）出現(xiàn)了3／4級治療相關不良反應，未出現(xiàn)治療相關死亡。該研究結果提示，Pembrolizumab單藥治療的耐受性良好，在NSCLC患者中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，Pembrolizumab治療獲益與腫瘤PD-L1的表達情況呈正相關。

2．2 Checkmate 057 研究 Checkmate 057 研究［18］是一項隨機開放的國際Ⅲ期臨床試驗，主要針對非鱗狀非小細胞肺癌患者正在使用或已使用含鉑兩藥方案化療分別予以Nivolumab和多西他賽單藥治療，應用抗PD-L1抗體克隆28-8和原型免疫組化分析來判定PD-L1狀態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)：Nivolumab組的中位生存時間為 12．2 個月（95%CI 9．7-15．0），高于多西他賽組中位生存時間［9．4 個月（95%CI 8．1-10．7）］；Nivolumab組的1年生存率為51%，而多西他賽組的1年生存率為39%；Nivolumab組的有效率為19%vs多西他賽組的12%（P＝0．02）；雖然中位 PFS結果顯示Nivolumab組并不優(yōu)于多西他賽組（2．3個月vs 4．2個月），但是一年無進展生存率明顯高于多西他賽組（19%vs 8%）；安全性方面，Nivolumab組發(fā)生與治療相關的3～4級毒性反應的患者占10%，而多西他賽組占54%；根據(jù)預先指定的PD-L1表達級別（≥1%，≥5%，≥10%）所分亞組結果提示：Nivolumab在所有終點事件中較多西他賽均顯示出更好的療效。該研究表明，Nivolumab的療效與PD-L1的表達有相關性，PD-L1表達＞1%陽性者療效優(yōu)于表達陰性者。2．3 KEYNOTE024 研究 KEYNOTE024 研究［19］也是一項隨機開放的國際臨床Ⅲ期試驗，旨在評價Pembrolizumab較標準的含鉑化療應用于無EGFR及ALK驅(qū)動基因突變但高表達PD-L1（≥50%）的晚期NSCLC初治患者的有效性及安全性。研究發(fā)現(xiàn)：Pembrolizumab組的中位 PFS為 10．3個月（95%CI 6．7-未達到），而化療組的中位 PFS為 6．0個月（95%CI 4．2-6．2）；Pembrolizumab 組 6 個月的 OS 為 80．2%，化療組為72．4%；Pembrolizumab組和化療組的有效率為44．8%vs 27．8%；Pembrolizumab 組發(fā)生治療相關3／4／5 級不良反應比例為26．6%，化療組為53．3%，以上數(shù)據(jù)表明：與使用以鉑類為基礎的化療方案相比，晚期 NSCLC患者（PD-L1表達≥50%）使用Pembrolizumab有優(yōu)越的有效性和安全性，能夠明顯延長PFS和OS，不良反應相對較輕。這項研究具有里程碑式的意義，基于此，2016年 10月 24日，F(xiàn)DA批準Pembrolizumab（Keytruda）用于 PD-L1高表達（≥50%）的非小細胞肺癌患者的一線治療。

3 PD-L1作為NSCLC預測生物標志物的局限性及潛在標志物

在蛋白質(zhì)水平層面表達的PD-L1［20］，雖然是目前最常用的免疫療效預測標志物，但仍存在一定的局限性，表現(xiàn)在以下幾個方面。

首先，免疫組化檢測的PD-L1表達水平在臨床中有一定的預測價值，但由于在定義PD-L1染色陽性的過程中存在個人主觀性［21］，使得免疫組化染色不能準確地反映出PD-L1的真實表達水平，不同的研究中使用不同的單抗，使得定義PD-L1免疫組化染色陽性的臨界值不同。一些研究［17-18］中，達到最佳治療的臨界值設為50%腫瘤相關PD-L1和10%免疫細胞相關PD-L1，而另外一項研究［22］中將腫瘤相關 PD-L1表達水平臨界值設為1%。此外，由于免疫組化檢測存在技術缺陷，造成PD-L1免疫組織化學染色精確度低的因素包括以下三點：第一，染色抗體多樣，不同的研究中使用的抗體包括 M1H1、5H1、5H1-A3、2H11、27A2、405．9A11 和 E1L3N［23-29］，不同抗體在不同的研究中的敏感性和親和力是不同的。第二，在不同的研究中，PD-L1染色陽性的cut-off值不同。第三，免疫組織化學染色檢測平臺的不同也會使PD-L1檢測存在差異。目前，國外已有4種特異性PD-L1平臺檢測技術：Dako Link 48平臺上作22C3檢測、Dako Link 48平臺上作28-8檢測、Ventana Benchmark平臺上作SP142檢測以及Leica Bond平臺上作E1L3N檢測（實驗室研發(fā)檢測技術）。FDA目前已批準Dako Link 48平臺上28-8抗體特異性與nivolumab結合，Dako Link 48平臺上22C3抗體特異性與pembrolizumab結合，Ventana Benchmark平臺上SP142抗體特異性與atezolizumab結合。Rimm等［30］比較了這四種檢測抗體、檢測平臺在測定PD-L1時準確性和可靠性的差異，評價了腫瘤細胞表面與免疫細胞表面PD-L1表達的差異以及病理學家對不同方法結果解讀的差異，其研究發(fā)現(xiàn)：22C3、28-8及E1L3N檢測結果具有一致性，而SP142只能檢測出其他三種檢測方法檢測出的陽性病例的50%。且SP142無論在腫瘤細胞還是在免疫細胞上的PD-L1表達平均分上，均顯著低于其它三種檢測方法。配對比較顯示28-8和E1L3N檢測結果無顯著差異，22C3比28-8或E1L3N在檢測PD-L1表達水平上顯著要低，但是只采用13位病理學家評分的平均值時，22C3比28-8或E1L3N在檢測PD-L1表達水平上有統(tǒng)計意義的輕度降低。病理學家在對腫瘤細胞染色的評分上顯示出高度的一致性，但對免疫細胞抗體染色評分上一致性很差，提示免疫組化中無論選擇哪種檢測抗體和平臺，對免疫細胞上表達的PDL1的評價仍然不足。腫瘤細胞以50%為檢測閾值比1%為閾值有更高的一致性。1%的檢測閾值要求病理學家使用自動化系統(tǒng)或經(jīng)培訓的方法改進檢測的精確度。從上述研究結果來看，四種檢測方法中的三種（抗體22C3、28-8和E1L3N）結果是可以互換的，但是目前臨床上尚沒有一種檢測方法在交叉利用上得到證實。

其次，腫瘤細胞和某些免疫細胞群均可以表達PD-L1［31］。 有研究［32］表明某些 PD-1／PD-L1 抑制劑的敏感性與免疫細胞PD-L1表達水平相關，因此對免疫細胞表達的PD-L1水平的評估顯得更為重要。在適應性免疫反應方面，免疫細胞（如巨噬細胞、淋巴細胞）相關PD-L1表達的預測意義與腫瘤相關的PD-L1表達不同［32］。此外，腫瘤細胞PD-L1高表達和免疫細胞PD-L1低表達與肺腺癌患者較差預后有關［33］。因此，對于如何去鑒別浸潤位于腫瘤細胞與腫瘤細胞之間的免疫細胞、存在于侵襲性腫瘤細胞邊界或腫瘤塊周邊的免疫細胞以及存在于實質(zhì)內(nèi)淋巴細胞聚集處且遠離腫瘤塊的免疫細胞很有必要。

然后，由于腫瘤具有異質(zhì)性，腫瘤的PD-L1表達在原發(fā)病灶和轉移病灶中是不同的。腫瘤PD-L1表達有兩種形式：集中表達和分散表達。在許多腫瘤中，即使在同一標本中取材，不恰當?shù)幕顧z也會導致PD-L1表達檢測的偏差，評估PD-L1表達在腫瘤內(nèi)還是腫瘤外同樣也是一個難題，因此選擇合適的活檢部位對于檢測PD-L1表達是一個挑戰(zhàn)，需要更深入地研究和探討［34］。一些臨床試驗發(fā)現(xiàn)，PD-L1高表達是判斷療效的一個很好的指標，包括惡性黑色素瘤、NSCLC和RCC都能看到PD-L1高表達的患者更容易獲益［35-38］。但是，仍有PD-L1低表達的患者有很好的響應［39］。如何篩選出這部分患者，仍是一個未解難題。

最后，有研究［32，40］顯示，僅有胞膜表達的 PD-L1有生物學意義，無論是通過動態(tài)IFN-γ表達還是通過組成型癌基因激活表達。與癌基因介導的PD-L1表達相反，IFN-γ誘導的PD-L1表達代表著一種動態(tài)生物標志物，且出現(xiàn)在活動性炎癥部位。因此，分析胞膜上的PD-L1蛋白與臨床預后之間的關系要比胞內(nèi)PD-L1蛋白或mRNA更合理。

4 潛在的預測生物標志物

2015年ASCO公布了一項Ⅱ期臨床試驗，發(fā)現(xiàn)了第一個基因預測標志物-錯配修復（mismatch-repair，MMR）基因缺失能夠有效預測PD-1抑制劑的療效。MMR是在遺傳性非息肉性大腸癌中分離得到的一組遺傳易感基因，該基因突變會導致錯配修復功能缺陷，進而出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI），因而容易發(fā)生腫瘤。 Diaz 等［41］發(fā)現(xiàn) pembrolizumab治療錯配修復基因缺陷型腫瘤比含有錯配修復基因型腫瘤更有效。并提出了解釋這個現(xiàn)象的假設：錯配修復缺陷型腫瘤中突變相關的新抗原數(shù)量的增加刺激了抗腫瘤免疫反應。用PD-1單抗治療具有錯配修復基因缺陷型腫瘤可以鑒別特異性基因組改變并預測此治療的原發(fā)性耐藥。眾所周知，錯配修復缺陷型結直腸癌編碼Ⅱ型轉化生長因子β（transforming growth factor β， TGF-β）受體，而 TGF-β 信號通路被廣泛地研究于包括腫瘤免疫在內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)［42］。MMR的發(fā)現(xiàn)為免疫治療和基因組學搭建了一座橋梁。 有研究［43］證實，CD28／B7共刺激途徑對于腫瘤小鼠和慢性病毒感染期間有效的PD-1治療至關重要，腫瘤特異性的T細胞需要CD28分子的共刺激（co-stimulation）進行增殖和恢復有效的免疫反應，腫瘤患者抗PD-1治療后血液中CD8 T細胞增殖主要為CD28陽性，這項研究的發(fā)現(xiàn)表明存在于T細胞表面的CD28可能作為PD-1靶向藥物是否有效的預測生物標志物。CD8+T淋巴細胞和IFN-γ因其在腫瘤微環(huán)境中的重要作用也被作為候選預測生物標志物［44-45］。

5 總結與展望

免疫治療是繼化療、放療、手術等傳統(tǒng)治療和分子靶向治療后的又一治療手段，已經(jīng)成為當前全世界研究熱點。確定預測生物標志物有助于患者篩查和個體化治療。雖然PD-L1是目前最常用的免疫療效預測標志物，但其檢測仍存在一定的局限性，不能作為明確的標志物，未來我們需要進行更深入的研究來驗證PD-L1作為預測生物標志物的可行性，研制出一種囊括多層面的預測生物標志物體系，將諸如PD-L1檢查點抑制劑、腫瘤突變負荷、腫瘤免疫微環(huán)境等整合起來，以篩選出最適合進行免疫治療的人群，將免疫治療個體化、最優(yōu)化。

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