自噬與角質(zhì)形成細胞、扁平苔蘚的相關(guān)性研究

高亞麗，相文忠，宋秀祖

（安徽醫(yī)科大學(xué)杭州臨床學(xué)院/杭州市第三人民醫(yī)院，浙江 杭州310009）

自噬是真核生物中普遍存在的生物現(xiàn)象，可通過溶酶體途徑清除受損的細胞器及胞質(zhì)成分，維持細胞穩(wěn)態(tài)。近年來研究發(fā)現(xiàn)：自噬在多種皮膚病中發(fā)揮作用，包括銀屑病、白癜風(fēng)、感染性皮膚病、自身免疫性皮膚病及皮膚腫瘤等[1-2]。扁平苔蘚（LP）是一種發(fā)生于皮膚黏膜的慢性炎癥性疾病，其組織病理學(xué)的特征性變化是顆粒層楔形增厚、基底細胞液化變性及真皮上部淋巴細胞浸潤。LP發(fā)病機制至今尚未完全明確，多數(shù)認為LP是一種T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，皮損早期以CD4+T細胞浸潤為主，晚期以CD8+T細胞浸潤為主?；罨腃D4+T細胞可分泌IL-2、IL-12、INF-γ等；活化的CD8+T細胞可分泌TNF-α等細胞因子，引起角質(zhì)形成細胞凋亡[3-4]。LP皮損中浸潤的T細胞還可表達趨化因子受體CXCR3等，與角質(zhì)形成細胞表達的配體CXCL-10、CXCL-11，MIG等相互作用，參與T細胞的自我募集，進一步導(dǎo)致基底細胞液化變性[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬在角質(zhì)形成細胞的病理生理過程中發(fā)揮作用，參與了LP的發(fā)病，現(xiàn)綜述如下。

1 自噬概述

自噬是真核生物細胞中普遍存在的現(xiàn)象，由諾貝爾獎得主克里斯汀·德·迪夫于1963年首次提出，被描述成胞質(zhì)成分在溶酶體中的降解過程[2]。根據(jù)細胞內(nèi)底物運送到溶酶體腔方式的不同，自噬可分為3種類型：巨自噬、微自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬，通常所講的自噬是指巨自噬。自噬發(fā)生時，胞漿中首先出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬前體，自噬前體包裹變性壞死的細胞器形成自噬體，自噬體在微管運輸下與溶酶體融合，形成單層膜的自噬溶酶體，加工降解其中內(nèi)容物。因此，自噬過程可主要分為以下步驟：自噬發(fā)生，自噬體延長與成熟，自噬體與溶酶體融合，自噬溶酶體降解[6]。基礎(chǔ)水平的自噬可清除細胞內(nèi)衰老或受損的細胞器以及異常聚集的蛋白質(zhì)，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在應(yīng)激條件下，細胞自噬水平增加，這被認為是細胞的自我保護性反應(yīng)，有助于細胞的適應(yīng)和存活[7-8]。

2 自噬與角質(zhì)形成細胞（KC）

2.1 自噬參與KC的分化 Aymard等[9]在用低糖高鈣M199培養(yǎng)基誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞（KC）分化的過程中，檢測到β1整合素表達明顯減少，分化蛋白外皮蛋白、角蛋白10（K10）表達增加；加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）后，β1整合素的表達增加，外皮蛋白、K10表達減少。進一步研究發(fā)現(xiàn)：在KC分化過程中，SIRT1和AMPK磷酸化表達增加，抑制了mTOR活化；自噬相關(guān)基因Atg5-Atg12，LC3-II及Beclin-1表達明顯升高，這些均表明自噬信號通路參與了KC的分化過程。Yoshihara等[10]將自噬相關(guān)基因Atg7缺失的小鼠皮膚移植到有免疫缺陷的小鼠背部，表皮出現(xiàn)棘層肥厚，角化過度，角化相關(guān)蛋白及自噬標記蛋白LC3表達均下降，進一步證實：自噬在表皮分化過程中發(fā)揮重要作用。細胞核的退化是KC終末分化的重要過程，核降解障礙可導(dǎo)致KC終末分化異常。自噬可通過激活A(yù)KT1途徑，促進細胞核的降解，有助于正常KC的終末分化；銀屑病皮損中表皮角化不全與KC的自噬障礙有關(guān)[11-12]。

2.2 自噬參與KC衰老及死亡 細胞老化是指隨著端粒消耗和氧化應(yīng)激，細胞最終出現(xiàn)了停滯狀態(tài)，并最終導(dǎo)致死亡。用百草枯或UVA照射誘導(dǎo)Atg7缺陷KC與正常KC的衰老，發(fā)現(xiàn)Atg7缺陷的KC出現(xiàn)更明顯的DNA損傷、細胞周期紊亂和衰老標記物增加等現(xiàn)象，推測自噬可能參與KC的衰老[13]。近年來研究表明：自噬參與了自噬性程序性細胞死亡[14]。Deruy等[15]研究發(fā)現(xiàn)老化的細胞中有大量氧化受損的線粒體和自噬體在細胞核聚集，這種自噬體可以被自噬抑制劑3-MA阻斷，用siRNA抑制Atg5表達也可以阻斷自噬體的聚集。Gosselin等[16]在未發(fā)現(xiàn)凋亡標記的老化KC中，觀察到Beclin-1等自噬相關(guān)蛋白的表達改變。老化的KC里包含了大量的自噬體囊泡、損傷的細胞核和線粒體；應(yīng)用3-MA可以延遲老化KC的死亡。因此推測，老化KC的死亡是高水平自噬體吞噬重要細胞器所致。

2.3 自噬參與緩解KC的炎癥 Toll樣受體（TLR）是固有免疫的重要識別分子，既可激活NF-κB通路參與炎癥反應(yīng)，也可促進自噬的發(fā)生。Lee等[17]用TLR激動劑MALP-2處理人原代KC，活化TLR2/6和TLR4受體，觀察到LC3表達增加，自噬激活；阻斷自噬可導(dǎo)致P62表達上調(diào)，炎癥因子表達增加；通過siRNA沉默P62，NF-κB和炎癥因子表達均下降。因此推測，KC的自噬可以負調(diào)控P62表達，避免KC產(chǎn)生過度炎癥。進一步研究也發(fā)現(xiàn)：皮膚炎癥過程中伴隨著P62過度表達，激活自噬可下調(diào)P62表達，從而抑制KC的炎癥反應(yīng)。AP1S3基因可編碼參與自噬體形成的相關(guān)蛋白，AP1S3基因敲除可導(dǎo)致KC自噬障礙，引起P62聚集和NF-κB激活；膿皰型銀屑病患者出現(xiàn)AP1S3基因突變，可導(dǎo)致自噬異常，炎癥介質(zhì)表達增加。以上進一步證實自噬參與KC的炎癥反應(yīng)[18]。

2.4 自噬參與KC中黑素顆粒降解 KC可通過溶酶體途徑降解細胞中的黑素顆粒。Murase等[19]用正常人KC與分離的黑素小體共培養(yǎng)，觀察黑素顆粒的降解情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抑制自噬相關(guān)蛋白Atg7表達，自噬標記蛋白LC3-Ⅱ活化減少，黑素相關(guān)蛋白PMEL17表達增加，表明黑素降解受到抑制；Atg13和抗紫外線輻射相關(guān)基因UVRAG敲除，也可發(fā)現(xiàn)類似的PMEL17蛋白聚集和大量p62累積。因此推測:自噬可通過溶酶體自噬機制參與KC中黑素顆粒的降解。

2.5 自噬參與KC的微生物防御 KC的自噬參與宿主防御外源性病原體的入侵及消除細胞內(nèi)病毒和微生物感染。研究表明:PI3K/Akt/mTOR途徑的激活，參與人類乳頭瘤病毒16型（HPV16）感染的早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；阻斷該通路激活自噬，可明顯抑制HPV16感染；用3-MA或Atg7基因敲除抑制自噬，則又加劇HPV16感染，延遲HPV16衣殼蛋白的降解[20-21]。由此證實：自噬在KC的病毒防御中發(fā)揮重要作用。此外，自噬還參與真菌感染過程，真菌產(chǎn)生的毒性因子如棒曲霉素，可抑制KC的自噬體降解途徑，導(dǎo)致P62聚集和大量活性氧產(chǎn)生，誘導(dǎo)KC凋亡[22]。

3 自噬與LP

自噬在KC中的作用參與多種皮膚病的發(fā)生發(fā)展。LP皮損也出現(xiàn)明顯的KC異常，主要表現(xiàn)為角化過度，顆粒層楔形增厚，棘層增生，基底細胞液化變性。近年來有研究表明LP的KC存在自噬功能障礙。對皮損進行免疫組化研究發(fā)現(xiàn)：與正常的口腔黏膜相比，LP表皮中自噬相關(guān)蛋白p-mTOR、LC3B的表達水平明顯增加；此外正常表皮中，自噬基因Atg5、Atg7主要在棘層細胞中表達，而在LP患者中，Atg5、Atg7可在表皮全層均有表達，且陽性染色增強[23-24]。以上均表明KC的自噬異常可能參與了LP的發(fā)病機制。且自噬與LP發(fā)病的多方面密切相關(guān)。

3.1 臨床表型 從口腔扁平苔蘚（OLP）患者的外周血T細胞中提取RNA進行自噬基因表達研究，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因IGF1表達顯著增加，與男性或其他年齡組相比，中年女性O(shè)LP患者的IGF1表達更高。IGF1是自噬重要調(diào)節(jié)因子，可以控制應(yīng)激狀態(tài)下自噬過度活化，調(diào)節(jié)外周淋巴細胞增殖和分化。IGF1在中年女性患者中的高表達與OLP好發(fā)于中年女性的臨床特征是一致的。進一步研究也發(fā)現(xiàn)：OLP患者T細胞中Atg9B表達下降，且在非糜爛型OLP患者中的表達比糜爛型OLP患者中更低，這均表明OLP患者T細胞中存在自噬功能障礙，并且與臨床表型相關(guān)[25]。

3.2 疾病嚴重程度 Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，OLP患者皮損和局部 T細胞中 p-Akt，p-mTOR，ULK1，LC3的表達均增加，且LC3表達水平與OLP疾病評分呈負相關(guān)。LC3在非糜爛型OLP患者皮損中表達比在糜爛型OLP患者中更高，表明自噬途徑的激活在OLP發(fā)病中發(fā)揮重要作用，且LC3水平可作為OLP疾病嚴重程度的一個監(jiān)測指標。

3.3 預(yù)防惡變 常珍等通過免疫組化方法檢測Atg5、Atg7在正?？谇火つ?、糜爛型OLP和口腔鱗狀細胞癌組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Atg5、Atg7在3種組織中均呈陽性表達，與正?？谇火つは啾?，在糜爛型OLP組織中表達升高，在口腔鱗狀細胞癌組織中表達下降。推測：自噬一方面通過降解受損的蛋白質(zhì)和細胞器等減少毒性產(chǎn)物蓄積，減少細胞損傷緩解慢性炎癥；另一方面作為程序性細胞死亡的方式可以抑制細胞過度增殖進而抑制腫瘤發(fā)生。因此可推測自噬在OLP的惡變過程中起到保護性作用[24]。

4 小結(jié)

自噬參與多種自身免疫性皮膚病的發(fā)病，如銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬皮病、白癜風(fēng)等。LP被認為是一種自身免疫性疾病，研究發(fā)現(xiàn)多個自噬相關(guān)基因及蛋白在LP中表達增加，表明自噬參與了LP的發(fā)病。角質(zhì)形成細胞的自噬機制參與了維持皮膚穩(wěn)態(tài)，角質(zhì)形成細胞的自噬異常在LP發(fā)病中的具體作用機制尚未明確。完善自噬與LP的相關(guān)研究可進一步闡明LP的發(fā)病機制，為LP的治療提供新的思路。