消化道微生態(tài)標(biāo)準(zhǔn)化樣本庫(kù)共識(shí)

中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)組織生物樣本庫(kù)分會(huì) 中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備協(xié)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)微生態(tài)學(xué)組及生物樣本庫(kù)學(xué)組 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)微生態(tài)、生物樣本庫(kù)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)作組

生物樣本庫(kù)主要是指標(biāo)準(zhǔn)化采集、處理、儲(chǔ)存和應(yīng)用健康和疾病生物體的器官、組織、細(xì)胞、血液、體液、分泌物、排泄物以及生物大分子衍生物等各種生物樣本，以及與這些樣本相關(guān)的臨床、檢驗(yàn)、病理、影像、治療、隨訪、患者知情同意等信息，包括質(zhì)量控制、信息管理與應(yīng)用系統(tǒng)。

人類消化道生存著眾多微生物，包括細(xì)菌、古生菌、真菌、病毒、原蟲等[1]。腸道微生物與宿主長(zhǎng)期共同進(jìn)化，構(gòu)成腸道微生態(tài)，影響著宿主的健康。隨著測(cè)序等高通量技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，以消化道微生態(tài)(主要是細(xì)菌和真菌)樣本為基礎(chǔ)的研究將我們對(duì)消化道微生態(tài)的認(rèn)知和應(yīng)用向前推進(jìn)了一大步[2]，成為國(guó)內(nèi)外重要的研究熱點(diǎn)。消化道微生態(tài)樣本的采集、制備、儲(chǔ)存等是后續(xù)研究的第一步，對(duì)檢測(cè)和分析結(jié)果有著重要的影響[3]。統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、高質(zhì)量的生物樣本是研究數(shù)據(jù)真實(shí)性、可重復(fù)性、一致性以及整合數(shù)據(jù)和應(yīng)用等的基礎(chǔ)，也是進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床大數(shù)據(jù)研究的重要保障。消化道微生態(tài)樣本可用于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、培養(yǎng)組學(xué)、營(yíng)養(yǎng)組學(xué)、微生態(tài)移植、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)等多方面的研究。目前尚缺乏消化道微生態(tài)樣本庫(kù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，制訂相關(guān)共識(shí)意見(jiàn)非常迫切和必要。

本共識(shí)意見(jiàn)主要針對(duì)消化道微生態(tài)研究相關(guān)樣本的采集、制備、存儲(chǔ)等標(biāo)準(zhǔn)化達(dá)成共識(shí)，包括糞便、黏膜組織、血液、膽道相關(guān)樣本和口腔微生物樣本。由臨床消化、倫理、消化道微生態(tài)研究、微生物組測(cè)序分析、生物樣本庫(kù)等多學(xué)科專家組成工作組，通過(guò)檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)、中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)、萬(wàn)方全文數(shù)據(jù)庫(kù)等，參考《生物標(biāo)本采集技術(shù)規(guī)范及數(shù)據(jù)庫(kù)建立指南》、《中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)(試行)》和《ISBER生物樣本庫(kù)最佳實(shí)踐2018》，遵照我國(guó)原國(guó)家衛(wèi)生計(jì)劃生育委員會(huì)《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》(2016)、世界醫(yī)學(xué)會(huì)《赫爾辛基宣言》、國(guó)際醫(yī)學(xué)科學(xué)組織委員會(huì)《涉及人類受試者的生物醫(yī)學(xué)研究國(guó)際倫理準(zhǔn)則》等，形成共識(shí)意見(jiàn)草案，經(jīng)工作組共同修改、討論而成。

1 范圍與定義

本共識(shí)意見(jiàn)主要包括消化道微生態(tài)生物樣本(糞便、消化道黏膜活檢組織、血液、膽道相關(guān)樣本、口腔微生物樣本)的采集、制備、儲(chǔ)存等流程和臨床資源數(shù)據(jù)庫(kù)管理的基本方法。

2 引文

下列文件為本共識(shí)的必需文件。凡是注明日期的引用文件，僅注明日期的版本適用于本共識(shí)。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本(包括所有修改單)適用于本共識(shí)。

GB/T 1.1-2009 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫

GB/T 20000 標(biāo)準(zhǔn)化工作指南

GB/T 20001 標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則

GB/T 12905-2000 條碼術(shù)語(yǔ)

GB/T 17172-1997417 條碼

GB/T 18347-2001128 條碼

GB 19489-2008 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T 20269-2006 信息安全技術(shù) 信息系統(tǒng)安全管理要求

GB/T 22278-2008 良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范原則

CNAS-CL05-2009 實(shí)驗(yàn)室生物安全認(rèn)可準(zhǔn)則

WS/T224-2002 真空采血管及其添加劑

世界衛(wèi)生組織 實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè) 第3版

3 術(shù)語(yǔ)與定義

3.1 樣本 指在特定時(shí)間從參與者中采集的器官、組織、分泌物、排泄物等標(biāo)本。

3.2 生物樣本庫(kù) 指接收、儲(chǔ)存、處理、分發(fā)樣本的實(shí)體。樣本庫(kù)包含其地理位置以及與其運(yùn)營(yíng)相關(guān)的所有活動(dòng)。

3.3 質(zhì)量控制 指為使樣本達(dá)到入庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)所采取的操作技術(shù)和活動(dòng)。

3.4 樣本編碼 指根據(jù)編碼規(guī)則對(duì)樣本進(jìn)行編號(hào)的過(guò)程。

3.5 實(shí)驗(yàn)室生物安全 指實(shí)驗(yàn)室的生物安全條件和狀態(tài)不低于允許水平，并符合相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全責(zé)任的要求，避免實(shí)驗(yàn)室人員、來(lái)訪人員、社區(qū)和環(huán)境受到不可接受的損害。

3.6 質(zhì)量管理體系 為實(shí)現(xiàn)質(zhì)量管理的方針目標(biāo)、有效開(kāi)展各項(xiàng)質(zhì)量管理活動(dòng)，需建立相應(yīng)的管理體系，這一體系即為質(zhì)量管理體系。相關(guān)文件包括：質(zhì)量手冊(cè)、程序文件、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和記錄。

3.7 信息管理系統(tǒng) 指用于管理人類樣本庫(kù)所儲(chǔ)存的生物樣本及其相關(guān)臨床、病理、隨訪、倫理審查、知情同意等信息的應(yīng)用軟件和硬件。

3.8 知情同意 獲得樣本捐贈(zèng)者的知情同意是法律和倫理的重要原則和要求。指具有完全民事行為能力的個(gè)人，在充分獲取信息(包括研究性質(zhì)、內(nèi)容、風(fēng)險(xiǎn)、受益、持續(xù)時(shí)間等)并準(zhǔn)確理解其內(nèi)容后，作出是否參與研究的決定，此決定不受恐嚇、利誘、壓力或其他不當(dāng)因素的影響。由于微生態(tài)樣本庫(kù)帶給個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)較小，建議采用廣泛同意模式，無(wú)需在未來(lái)研究中征求二次同意。

3.9 倫理審查委員會(huì) 建立消化道微生態(tài)樣本庫(kù)以及開(kāi)展相關(guān)研究應(yīng)提交相關(guān)單位倫理審查委員會(huì)審查，經(jīng)批準(zhǔn)后才可開(kāi)展研究。 該委員會(huì)的組成和一切活動(dòng)不應(yīng)受臨床試驗(yàn)組織和實(shí)施者的干擾或影響。

4 標(biāo)準(zhǔn)化消化道微生態(tài)樣本庫(kù)設(shè)施、設(shè)備和安全管理

4.1 標(biāo)準(zhǔn)化消化道微生態(tài)樣本庫(kù)設(shè)施和設(shè)備 參考《中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)(試行)》和《ISBER生物樣本庫(kù)最佳實(shí)踐2018》。

4.2 樣本庫(kù)人員安全 樣本庫(kù)操作人員日常要進(jìn)行生物樣本的采集、分裝、入庫(kù)、出庫(kù)等操作，在此過(guò)程中面臨各種風(fēng)險(xiǎn)，因此需做好個(gè)人防護(hù)，包括穿工作服、帶口罩、手套、帽子等，同時(shí)對(duì)樣本操作中產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)按照醫(yī)療廢棄物管理?xiàng)l例進(jìn)行處置。

4.3 樣本庫(kù)人員操作安全

4.3.1 超低溫冰箱操作安全 超低溫冰箱是樣本庫(kù)的主要凍存設(shè)備之一，屬常規(guī)操作設(shè)備，樣本庫(kù)操作人員在進(jìn)行超低溫冰箱操作時(shí)，必須佩戴手套，以防止凍傷。

4.3.2 液氮操作安全 樣本庫(kù)操作人員在使用液氮罐或取用液氮進(jìn)行樣本處理操作時(shí)，必須穿戴防護(hù)服，佩戴面罩或眼罩和手套，以防止凍傷。

4.3.3 干冰操作安全 樣本庫(kù)操作人員在進(jìn)行樣本采集、分裝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中可能會(huì)使用干冰降溫，操作過(guò)程中需穿戴防護(hù)服、手套和口罩，盡量減少皮膚暴露。干冰操作應(yīng)盡量在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行。

4.4 配備和維護(hù)有關(guān)設(shè)施、設(shè)備，保障樣本安全

4.4.1 樣本庫(kù)安全設(shè)計(jì) 樣本庫(kù)設(shè)計(jì)時(shí)需考慮設(shè)施和設(shè)備的安全。存放樣本庫(kù)的樓層需做加固處理，需準(zhǔn)確計(jì)算存儲(chǔ)設(shè)備滿載后的最大負(fù)重。為確保樣本存儲(chǔ)冰箱正常工作，樣本庫(kù)需設(shè)置備用應(yīng)急電路和制冷系統(tǒng)。

4.4.2 樣本庫(kù)設(shè)備定期維護(hù) 樣本庫(kù)超低溫冰箱等凍存設(shè)備需做好監(jiān)控記錄，定期維護(hù)保養(yǎng)。對(duì)于重要的樣本，建議在2臺(tái)冰箱中分開(kāi)儲(chǔ)存，如有條件可進(jìn)行異地備份儲(chǔ)存。

4.4.3 樣本庫(kù)應(yīng)急預(yù)案制訂 樣本庫(kù)應(yīng)制訂尤其是超低溫冰箱的應(yīng)急處置預(yù)案，由樣本庫(kù)主管確保其實(shí)施。預(yù)案中需明確遇突發(fā)情況時(shí)冰箱鑰匙的存放位置以及轉(zhuǎn)運(yùn)樣本時(shí)所需的低溫設(shè)備如轉(zhuǎn)運(yùn)盒、冰袋等，最大程度地降低樣本庫(kù)安全風(fēng)險(xiǎn)。

4.5 樣本庫(kù)數(shù)據(jù)安全

4.5.1 樣本數(shù)據(jù)安全 樣本信息是樣本的重要組成部分，是關(guān)系樣本質(zhì)量的重要衡量指標(biāo)，因此樣本的信息安全至關(guān)重要。對(duì)于樣本采集過(guò)程中常規(guī)登記的信息，需指定專人負(fù)責(zé)登記記錄的保管；個(gè)人計(jì)算機(jī)或?qū)嶒?yàn)室共用計(jì)算機(jī)錄入的樣本電子信息，需對(duì)涉及捐贈(zèng)者信息的文件進(jìn)行密碼保護(hù)和定期備份。

4.5.2 樣本數(shù)據(jù)傳遞時(shí)的安全 在進(jìn)行樣本共享和轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，會(huì)涉及樣本信息的傳遞，樣本庫(kù)管理人員需對(duì)捐贈(zèng)者和患者的隱私信息進(jìn)行相關(guān)處理，如使用樣本庫(kù)編號(hào)，去除捐贈(zèng)者和患者的其他個(gè)人身份信息。盡量避免將數(shù)據(jù)存放在移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備中，必須通過(guò)U盤、移動(dòng)硬盤或郵件傳遞時(shí)，需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行加密處理，防止移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備丟失或數(shù)據(jù)被截獲造成的倫理風(fēng)險(xiǎn)。

5 倫理審批與知情同意

5.1 倫理審批 研究方案、樣本采集方案、知情同意書等材料應(yīng)經(jīng)本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意后使用。此外，任何研究方案等文件的修改均須再次獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)才能實(shí)施，同時(shí)按照我國(guó)相關(guān)法規(guī)和倫理委員會(huì)的要求及時(shí)遞交其他跟蹤審查文件。倫理委員會(huì)有權(quán)利全程監(jiān)督和跟蹤審查樣本采集、儲(chǔ)存、管理、分享、結(jié)果發(fā)布的全過(guò)程。

5.2 知情同意 人類消化道微生態(tài)樣本庫(kù)的工作人員應(yīng)提前對(duì)風(fēng)險(xiǎn)與收益進(jìn)行有效評(píng)估，確保樣本參與者或其近親屬對(duì)項(xiàng)目信息充分知情、理解相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)、形成全面和準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，自愿作出是否同意的決定，然后簽署知情同意書[4-5]。另需明確告知樣本提供者有拒絕的權(quán)利，不參與捐獻(xiàn)樣本不會(huì)影響其接受常規(guī)的醫(yī)療服務(wù)[4-5]。

5.3 隱私保護(hù)措施 研究人員、醫(yī)務(wù)人員應(yīng)對(duì)樣本參與者的個(gè)人信息采取匿名化或編碼處理，確保參與者的個(gè)人信息不被泄露。若有充分理由要求參與者提供個(gè)人信息，需提請(qǐng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。違反法律規(guī)定導(dǎo)致隱私信息泄露，應(yīng)依法追究民事責(zé)任、行政責(zé)任和刑事責(zé)任。

5.4 安全保護(hù) 研究人員或相關(guān)醫(yī)務(wù)人員在獲取樣本的過(guò)程中應(yīng)盡量做到風(fēng)險(xiǎn)最小化，不增加樣本參與者的額外風(fēng)險(xiǎn)，避免為獲取樣本而置樣本參與者于危險(xiǎn)之中。如樣本參與者發(fā)生不良反應(yīng)，應(yīng)采取緊急處理措施對(duì)其進(jìn)行救治。

6 消化道微生態(tài)樣本庫(kù)樣本采集和管理

6.1 樣本采集前處理 由于存在諸多宿主和環(huán)境因素會(huì)影響微生物群[6]，微生物組研究設(shè)計(jì)應(yīng)考慮相關(guān)臨床數(shù)據(jù)的收集[7-8]。這些因素包括個(gè)人基本信息(性別、年齡、出生日期、居住地、居住環(huán)境、職業(yè)等)、醫(yī)療相關(guān)信息(既往史、抗菌藥物、化療藥物和其他相關(guān)藥物使用史、手術(shù)史、個(gè)人史等)、消化道微生態(tài)相關(guān)信息(飲食習(xí)慣、益生菌/益生元、食物補(bǔ)充劑、排便習(xí)慣、排便時(shí)間等)等[9]。應(yīng)根據(jù)研究目標(biāo)設(shè)計(jì)實(shí)用、高效的臨床數(shù)據(jù)收集項(xiàng)目。

①對(duì)于已知危害的樣本，根據(jù)世界衛(wèi)生組織《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》的規(guī)定，做好相應(yīng)級(jí)別生物安全水平的個(gè)體防護(hù)，嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行操作。

②對(duì)于未知危害、被認(rèn)為存在潛在感染性的樣本，樣本采集工作人員應(yīng)根據(jù)可能的感染風(fēng)險(xiǎn)做好相應(yīng)的防護(hù)措施。

③應(yīng)根據(jù)樣本類型和要求，盡可能提供潔凈無(wú)菌的環(huán)境用于樣本采集，避免樣本污染。

④樣本采集完成后應(yīng)記錄樣本基本信息。樣本基本信息主要包括：樣本類型、采樣量、樣本編號(hào)等；黏膜組織樣本采集時(shí)應(yīng)按照《臨床技術(shù)操作規(guī)范：病理學(xué)分冊(cè)》對(duì)樣本進(jìn)行詳細(xì)、清晰的描述。應(yīng)記錄樣本捐贈(zèng)者的個(gè)人基本信息、臨床信息、隨訪信息等。個(gè)人基本信息主要包括：性別、年齡、身份證、居住地等；臨床信息主要包括：捐贈(zèng)者基本健康信息、既往史、家族史等；對(duì)于遺傳疾病樣本，還應(yīng)記錄捐贈(zèng)者的家系信息如家族成員及其疾病史、成員婚配情況等。此外，對(duì)捐贈(zèng)者的飲食習(xí)慣、生活環(huán)境狀況等也需采集。

⑤采集工作人員應(yīng)對(duì)整個(gè)采集過(guò)程進(jìn)行記錄，其中包括但不限于知情同意書、調(diào)查問(wèn)卷以及容器編號(hào)、采集地點(diǎn)、采集方法、采集日期、樣本采集各個(gè)步驟的時(shí)間和人員信息。

⑥樣本相關(guān)信息的記錄可以使用信息系統(tǒng)自帶的記錄功能，也可由工作人員填寫表格進(jìn)行記錄。

⑦需考慮到生物樣本和相關(guān)資料將用于基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究，其特殊性和可操作性都要兼顧。

6.2 消化道微生態(tài)樣本采集和保存

6.2.1 糞便樣本采集和保存

6.2.1.1 糞便樣本的采集 采集容器需滿足無(wú)菌、密封要求。建議采用專用采集裝置[8]。采集過(guò)程中應(yīng)避免尿液等污染。

6.2.1.2 糞便樣本的運(yùn)輸 糞便標(biāo)本應(yīng)立即凍存于-80 ℃，此為新鮮糞便樣本保存的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10-12]。糞便保存裝置內(nèi)應(yīng)保持厭氧環(huán)境[13-14]，厭氧環(huán)境裝置不與糞便樣本直接接觸[3]。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議采集后15 min內(nèi)快速凍存或置于含保存液的密封容器內(nèi)[15]。應(yīng)盡量縮短糞便標(biāo)本排出體外后暴露于室溫空氣中至凍存的時(shí)間，有研究提示不應(yīng)超過(guò)2 h[3]，但根據(jù)研究目的不同，2 h也可能會(huì)影響某些研究結(jié)果。

運(yùn)輸時(shí)間在24 h內(nèi)，可以接受4 ℃冷藏運(yùn)輸，但受溫度影響較大的微生物活性會(huì)降低甚至死亡，應(yīng)根據(jù)研究目的確定是否采用[16]。運(yùn)輸時(shí)間在24 h至1周內(nèi)，應(yīng)采用干冰運(yùn)輸。條件受限不能采用低溫運(yùn)輸時(shí)，可采用以下室溫保存方法臨時(shí)保存，如：RNAlater穩(wěn)定液[17]、95%乙醇[17]、糞便隱血檢測(cè)卡[17]、無(wú)水乙醇[18]、異硫氰酸胍溶液[15]、凍干法[18]。上述室溫保存方法在用于測(cè)序以外的目的，如培養(yǎng)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)，應(yīng)慎重考量該類保存方法對(duì)樣本培養(yǎng)與檢測(cè)結(jié)果的影響，權(quán)衡利弊后決定是否采用。此外，還可采用商業(yè)試劑盒，如OMNIgene·GUT等。

6.2.1.3 糞便樣本的分裝 糞便樣本應(yīng)等分、足量分裝至凍存管等密封容器，超低溫(-80 ℃)保存，避免反復(fù)凍融，以免DNA降解[9]。分裝時(shí)為避免空氣對(duì)樣本的影響，應(yīng)盡量選取糞便標(biāo)本內(nèi)部未接觸空氣的部分[16]，每份標(biāo)本質(zhì)量不低于200 mg(去除食物殘?jiān)?。標(biāo)本質(zhì)量為25 mg時(shí)可能不影響DNA提取和測(cè)序，但應(yīng)謹(jǐn)慎采用[10]。

6.2.2 消化道黏膜內(nèi)鏡活檢樣本和結(jié)腸灌洗樣本采集和保存

6.2.2.1 內(nèi)鏡黏膜活檢樣本 根據(jù)研究目的采用選擇性活檢(最典型部位活檢)或定位性活檢(固定部位活檢)[19]，為避免黏膜出血對(duì)活檢標(biāo)本的影響，同一部位需采集多個(gè)標(biāo)本時(shí)應(yīng)更換活檢位置。采集時(shí)應(yīng)避免黏膜組織被胃腸道內(nèi)容物污染，BABD活檢鉗(Brisbane Aseptic Biopsy Device)能防止交叉污染[20]?；顧z標(biāo)本應(yīng)及時(shí)放入無(wú)菌凍存管，轉(zhuǎn)入-80 ℃凍存[20]。

6.2.2.2 結(jié)腸灌洗樣本 結(jié)腸灌洗標(biāo)本可以替代結(jié)腸內(nèi)鏡活檢樣本用于消化道微生物研究[21]。結(jié)腸鏡檢查前應(yīng)多飲水沖洗腸道，檢查前6 h行腸道準(zhǔn)備，于乙狀結(jié)腸處吸取5 mL無(wú)糞塊污染的灌洗標(biāo)本放入無(wú)菌凍存管，立即置于液氮或-80 ℃凍存。

6.2.3 血液樣本采集和保存 細(xì)菌在人體外周血液各成分中的分布并不均勻[22]，建議選擇全血標(biāo)本。研究特定問(wèn)題時(shí)，可根據(jù)研究目的選擇合適的標(biāo)本，包括全血、血沉棕黃層、血清、血漿、血細(xì)胞等[22-23]。紅細(xì)胞中細(xì)菌豐度變化較大，不應(yīng)棄用[22]。血液樣本中微生物豐度較低，需注意標(biāo)本采集、核酸提取和擴(kuò)增、測(cè)序的各個(gè)步驟均可能造成污染，應(yīng)予避免。血液標(biāo)本采集、處理時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)范，預(yù)防污染。標(biāo)本采集、處理所用物品應(yīng)采用相應(yīng)方法(紫外線照射、選擇性酶降解等)消除潛在的核酸污染。標(biāo)本采集、處理步驟中應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照[22,24-28]。應(yīng)通過(guò)靜脈穿刺采集，推薦使用肘正中靜脈等污染率低的部位。建議陰性對(duì)照樣本同時(shí)進(jìn)行測(cè)序[28]。

標(biāo)本采集、處理后應(yīng)直接凍存或加用RNAlater穩(wěn)定液后轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃保存。為避免試劑、批次等因素對(duì)結(jié)果的影響，推薦集齊標(biāo)本后再集中檢測(cè)[29]，標(biāo)本處理順序應(yīng)隨機(jī)化。如為提取DNA后保存，應(yīng)根據(jù)研究目的，采用相應(yīng)的方法提取后，置于-20 ℃[30]或-80 ℃保存[23-27]。實(shí)驗(yàn)室無(wú)相應(yīng)條件時(shí)，不建議進(jìn)行進(jìn)一步處理。標(biāo)本應(yīng)在解凍后12 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，避免反復(fù)凍融。

6.2.4 膽道相關(guān)樣本采集和保存

6.2.4.1 膽道黏膜樣本 外科腹腔鏡或開(kāi)腹膽囊切除術(shù)后留取膽囊標(biāo)本，以無(wú)菌水沖洗后及時(shí)凍存或放入RNAlater穩(wěn)定液中，轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃凍存；或經(jīng)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)(endoscopic retrograde cholangio-pancreatography，ERCP)途徑以活檢鉗取膽管活檢3～4塊，標(biāo)準(zhǔn)程序獲取的組織標(biāo)本可被胃腸道內(nèi)容物污染，應(yīng)予注意，保存方法同前所述。

6.2.4.2 膽結(jié)石樣本 經(jīng)外科手術(shù)、ERCP等途徑獲取膽結(jié)石標(biāo)本，以無(wú)菌水反復(fù)沖洗表面膽汁等附著物，自然風(fēng)干后置入無(wú)菌瓶?jī)?nèi)，-80 ℃凍存。

6.2.4.3 膽汁樣本 經(jīng)ERCP膽總管插管成功后，建議更換造影管，使用新的造影管接近十二指腸乳頭開(kāi)口，以無(wú)菌水沖洗(或以無(wú)菌水沖洗乳頭切開(kāi)刀)后插入膽道，采用無(wú)菌空注射器抽吸膽汁5～10 mL；或膽系疾病在外科手術(shù)中以無(wú)菌注射針穿刺抽取膽汁。吸取的樣本立即放入無(wú)菌凍存管中，轉(zhuǎn)入-80 ℃凍存。

6.2.5 口腔微生物樣本采集和保存 應(yīng)完整、詳細(xì)地記錄口腔病史和診療、檢查情況。取樣前30 min以清水將口腔內(nèi)雜物洗漱干凈，勿再進(jìn)食、飲水、吸煙等。

6.2.5.1 唾液樣本 清水漱口后靜坐10 min。使用50 mL無(wú)菌離心管收集非刺激性唾液，唾液含于口中至少1 min，然后吐到無(wú)菌離心管或含DNA穩(wěn)定劑的樣品保存管中，此過(guò)程可重復(fù)多次，最后收集2～5 mL樣本。建議采用非刺激性唾液采集法，如采集有困難，可考慮采用刺激性唾液采集法[31]。采集完成后將樣本置于冰上，2 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃凍存。含DNA穩(wěn)定劑的樣品短期內(nèi)可常溫保存。

6.2.5.2 口腔拭子樣本 采用以無(wú)菌0.9% NaCl溶液或磷酸緩沖鹽溶液潤(rùn)濕的無(wú)菌拭子取樣。舌背部、腭扁桃體、咽喉部刮取5 s，口腔黏膜、上顎、角質(zhì)化牙齦刮取10 s，避免觸碰其他部位。樣本刮取后立即封存于無(wú)菌凍存管置于冰上，2 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃凍存或置于含DNA穩(wěn)定劑的樣品保存管內(nèi)保存。

6.2.5.3 牙菌斑樣本 分別記錄取樣部位：牙齒齦上或齦下牙菌斑。取樣前干燥取樣部位，使用口腔Gracey刮匙盡可能多地刮取牙菌斑(避免出血樣本)，將刮匙浸入含緩沖液的無(wú)菌離心管中5 s，離心管置于冰上，2 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃凍存。

7 消化道微生態(tài)樣本編碼

(1)使用標(biāo)簽、二維碼或條形碼的樣本編碼信息可包含樣本編號(hào)、疾病和樣本類型、采樣部位、采樣日期等。

(2)樣本應(yīng)有唯一的編號(hào)，但不能透露捐贈(zèng)者信息。

(3)樣本的儲(chǔ)存信息、研究數(shù)據(jù)等應(yīng)能通過(guò)唯一的樣本編號(hào)關(guān)聯(lián)到同一個(gè)樣本上。

8 消化道微生態(tài)臨床數(shù)據(jù)庫(kù)與信息管理系統(tǒng)

(1)樣本庫(kù)應(yīng)有統(tǒng)一、完整的信息系統(tǒng)或數(shù)據(jù)庫(kù)，用于樣本信息的記錄和儲(chǔ)存。

(2)所有樣本信息(采集、處理、儲(chǔ)存、使用信息、捐贈(zèng)者相關(guān)信息)和臨床信息均應(yīng)記錄于信息系統(tǒng)。臨床資料應(yīng)基于規(guī)范化的臨床診療。臨床治療過(guò)程記錄和隨訪資料應(yīng)完整。

(3)樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)宜與其他相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)(如樣本采集醫(yī)院的臨床數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)、其他樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng))兼容或關(guān)聯(lián)，以便共享樣本信息和數(shù)據(jù)。

(4)樣本庫(kù)數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)應(yīng)根據(jù)不同工作人員的職責(zé)設(shè)置不同管理和訪問(wèn)權(quán)限，以確保信息安全。

(5)樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)應(yīng)滿足樣本追蹤和檢索的需求。

(6)樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)應(yīng)建立安全保障，防止黑客入侵、計(jì)算機(jī)病毒傳播、數(shù)據(jù)損壞等意外情況。

(7)應(yīng)根據(jù)實(shí)際需求制訂備份周期，按周期對(duì)樣本信息和數(shù)據(jù)進(jìn)行備份，以應(yīng)對(duì)信息和數(shù)據(jù)的意外損壞，并及時(shí)進(jìn)行異地備份和歷史備份。

執(zhí)筆者：史以超，王子愷，楊云生

專家組單位和成員(按單位和姓氏拼音排序)

北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室(陳 峰)

北京諾禾致源科技股份有限公司(李旭歡，劉文彬，麥 茵)

大連醫(yī)科大學(xué)微生態(tài)教研室(袁杰力)

河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院兒科(張 琳)

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科(陳 燁)

上海嘉會(huì)國(guó)際醫(yī)院消化內(nèi)科(夏 璐)

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科(房靜遠(yuǎn))

上海芯超生物科技有限公司(華友佳)

上海張江生物銀行(張可浩)

深圳華大生命科學(xué)研究院(李曉平，肖 亮，鄒遠(yuǎn)強(qiáng))

深圳譜元科技有限公司(李少川，覃俊杰，楊仁濤)

生物芯片上海國(guó)家工程研究中心(郜恒駿)

同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院消化疾病研究所(何承志)

廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院生命倫理研究中心(馬永慧)

香港Asia Microbiota Bank(Jon Chang張建誠(chéng))

中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物流行病研究所(楊瑞馥)

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院臨床生物樣本庫(kù)(趙秀梅)

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科(彭麗華，史以超，王子愷，楊云生)

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(鄭鵬遠(yuǎn))