HPLC法測定喜樹嫩葉和成熟葉中喜樹堿含量季節(jié)性變化

劉波，楊梓桐，劉曦子，蘇祿暉，傅穎，朱麗紅，楊意

（1.上海市醫(yī)藥學(xué)校，上海 200135；2.上海市新竹園中學(xué)；3.南京大學(xué)金陵學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院；4.上海市浦東新區(qū)公路管理署）

喜樹（Camptotheca acuminata Decne.）為珙桐科（Nyssaceae）喜樹屬（Camptotheca Decne.）植物，為我國特有高大落葉喬木，主要分布于我國長江流域、西南各省區(qū)及印度部分地區(qū)，屬于國家二級保護(hù)樹種［1-2］。喜樹根、莖、葉、果實(shí)及種子中提取的喜樹堿（camptothecin，CPT）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種拓?fù)洚悩?gòu)酶I（Topoisomerase I）的抑制劑，具有廣譜抗癌活性，可用于胃癌、直腸癌、慢性粒細(xì)胞性白血病和急性淋巴細(xì)胞性白血病的治療［3-4］。進(jìn)入20世紀(jì)90年代后，美國、日本和英國等國家先后開展了對喜樹的研究和開發(fā)，喜樹成為繼紅豆杉之后又一個(gè)重要的木本抗癌藥用植物，成為世界性熱門研究課題。目前CPT可于喜樹各組織中分離獲得［5］。

近年來，國內(nèi)學(xué)者對CPT的研究取得了一定的成果［6-11］，但對喜樹葉中CPT含量的季節(jié)性變化研究較少［12-13］。喜樹葉作為CPT生產(chǎn)原料，不僅采收方便、受季節(jié)影響較小，且科學(xué)合理的采集量亦能減少對喜樹資源和生態(tài)環(huán)境的破壞，有利于喜樹資源的持續(xù)發(fā)展與利用，且研究表明，喜樹各組織中，嫩葉中CPT含量可以達(dá)到植株地上部分平均含量的4倍［13-14］。本研究應(yīng)用HPLC法對喜樹嫩葉和成熟葉中CPT含量的季節(jié)性變化規(guī)律進(jìn)行測定，以確定喜樹葉片采收的最佳時(shí)期，提高資源利用率和生產(chǎn)率，并對建立的HPLC法測定喜樹葉中CPT含量測定方法進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料 一年生、三年生和五年生喜樹，種源為四川都江堰。以植株新梢上的嫩葉（枝頂1～3位葉）和成熟葉（枝條中下部葉，葉片深綠色）作為試驗(yàn)材料。2016年4至11月，于每月中旬、月底采集喜樹嫩葉和成熟葉。采集時(shí)間均為早上9：00。所有樣品采集后均用清水洗凈，60℃烘干，恒重，粉碎至60目，干燥器中保存?zhèn)溆谩?.2 儀器與試劑 Jasco高效液相色譜儀（英國VG公司）、975型紫外檢測器（英國VG公司）、TG328A型電子天平（上海天平儀器廠）、Heraeus Biofuge 22R型高速冷凍離心機(jī)（德國Heraeus公司）、BuchiR210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）、索氏提取器（天津玻璃儀器廠）。乙腈（色譜純）、無水乙醇（分析純）、95%乙醇和蒸餾水。

1.3 色譜條件 色譜Waters ODS柱（25 cm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-水（V/V 4∶6）；流速1 m l/min；檢測波長 254 nm；進(jìn)樣量 10 μl；柱溫25℃。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取CPT標(biāo)準(zhǔn)品（購自Sigma公司）3.5mg，置于100ml容量瓶中，以乙腈-水（V/V 4∶6）為溶劑，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻、定容，備用。分別精密吸取CPT 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0m l于10m l容量瓶中，用相同溶劑定容至刻度，搖勻。按照上述色譜條件，分別取稀釋后樣品及原標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取峰面積的平均值。得峰面積（Y）與CPT濃度（X）的線性回歸方程：Y=1807.49X-1343，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。

1.5 CPT提取 精密稱取干燥喜樹葉粉3.000 g，用30 ml 95%乙醇，索氏提取8 h，提取3次，合并提取液。用移液管精密吸取提取液200μl，移入2ml離心管中，用95%乙醇稀釋6倍，12 000 r/min條件下離心5min，精密吸取上清液，直接進(jìn)樣，計(jì)算CPT提取率。

1.6 精密度測定 為考察進(jìn)樣精密度，每次精密取標(biāo)準(zhǔn)品液10μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得CPT峰值分別為60839.229、61045.234、60969.247、61099.508和60799.394，根據(jù)均值和標(biāo)準(zhǔn)差求得RSD為0.1896%，說明實(shí)驗(yàn)精密度較好。

1.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 將同批樣品平均分成3等份，按1.5項(xiàng)方法提取CPT，并按1.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行CPT含量測定，測得CPT含量分別為0.6998‰、0.6828‰和0.7192‰，均值為0.7004‰，根據(jù)均值和標(biāo)準(zhǔn)差求得RSD為2.1556%。方法重現(xiàn)性好，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

1.8 回收率測定 精密稱取樣品5份，分別加入適量CPT標(biāo)準(zhǔn)品，按1.5項(xiàng)方法提取CPT，分別測定并計(jì)算回收率。結(jié)果加樣提取回收率分別為98.64%、102.14%、98.03%、100.21%和99.44%，平均回收率為99.69%，根據(jù)均值和標(biāo)準(zhǔn)差求得RSD為1.6016%。

2 結(jié)果

2.1 喜樹葉片中CPT含量的季節(jié)性變化 對于三年生喜樹，在其一年生長過程中，嫩葉和成熟葉中CPT含量均為單峰曲線。從4月份至7月份，嫩葉與成熟葉中CPT含量均為上升趨勢，其中嫩葉、成熟葉均在7月中旬含量達(dá)到最大值，分別為1.0927‰和0.6998‰；然后嫩葉與成熟葉中CPT含量均呈降低趨勢，嫩葉與成熟葉中CPT含量均在11月份最低，分別為0.1314‰和0.0689‰。在整個(gè)生長期內(nèi)，嫩葉中CPT含量均高于同期成熟葉中的CPT含量。見圖1。

圖1 不同月份喜樹葉片中CPT含量變化

2.2 不同樹齡喜樹葉片中CPT含量比較 樹齡不同，喜樹葉片中的CPT含量亦不相同。隨著樹齡的增大，其葉片中的CPT含量呈下降趨勢，即一年生喜樹葉片中CPT含量＞三年生喜樹葉片中CPT含量＞五年生喜樹葉片中CPT含量。見圖2。

圖2 不同樹齡喜樹葉片中CPT含量變化

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在喜樹一年生長過程中，無論是嫩葉還是成熟葉，CPT含量變化均為單峰曲線，這一研究結(jié)果與張玉紅等［12］的研究結(jié)論相同，且嫩葉與成熟葉中CPT含量最高值均出現(xiàn)在7月中旬，主要是這個(gè)時(shí)期，光照、水分及其他生態(tài)因子均適宜喜樹生長，喜樹的各種生理活動旺盛，合成的次生代謝產(chǎn)物CPT的速率較快。而郭勇等［13］研究顯示，喜樹無論是嫩葉還是成熟葉，在生長期內(nèi)，其CPT含量變化均為雙峰曲線，分別在6月和9月達(dá)到峰值，其中以6月份CPT含量最高。植物體內(nèi)經(jīng)常是多種生物堿并存，它們在量上的比例可能受遺傳基因的控制，且隨不同生長發(fā)育時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)化或消長［15］。因此對不同樹齡喜樹葉片中CPT含量動態(tài)變化進(jìn)行研究具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究結(jié)果顯示葉片中的CPT含量隨著樹齡的增大而降低。Liu等［14］研究發(fā)現(xiàn)，葉片中的CPT含量會隨著樹齡增大呈現(xiàn)迅速下降的趨勢，與本研究結(jié)果一致。

本研究中，HPLC法測定喜樹嫩葉和成熟葉中CPT含量，CPT含量與峰面積在0.035～0.35mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.9995）；精密度和穩(wěn)定性較好，方法重現(xiàn)性好，喜樹堿回收率較高，平均回收率達(dá)99.69%。說明應(yīng)用HPLC測定喜樹嫩葉與成熟葉中CPT含量的季節(jié)性變化的方法準(zhǔn)確可靠。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，CPT及羥基CPT均有較強(qiáng)的紫外吸收，其中以CPT的吸收更強(qiáng)［13］，故用HPLC法測定CPT含量專屬性強(qiáng)，分析速度快，靈敏度高。

馬錦星等［15］應(yīng)用HPLC測定羥基CPT及CPT含量，研究結(jié)果表明，HPLC法可作為原料及其制劑的含量測定方法。黃瑞松等［8］通過HPLC法對不同產(chǎn)地喜樹果中的CPT含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，建立的喜樹果定量測定方法準(zhǔn)確可靠。王軼等［16］等建立了HPLC-熒光檢測測定方法測定微量喜樹樣品中的CPT，這一方法僅需2mg干質(zhì)量植物樣品即可實(shí)現(xiàn)對CPT的測定，對HPLC法測定CPT進(jìn)行了探索改良，為微量植物材料中CPT的測定提供了有效方法。

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