貼壁法與懸浮法誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的對(duì)比研究

李獻(xiàn)帥 陳獻(xiàn)國(guó) 樓 洋 許 博 徐小義

用體外誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞重建損傷心肌是目前的研究熱點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞在備選干細(xì)胞中，最具發(fā)育潛能性和研究?jī)r(jià)值。目前胚胎干細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法已經(jīng)很成熟，滿足大量培養(yǎng)和擴(kuò)增的需要，并可定向分化為心肌細(xì)胞[1-3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞移植到體內(nèi)后仍表現(xiàn)出非凡的擴(kuò)增能力[4-7]，這意味著干細(xì)胞移植修復(fù)心肌細(xì)胞將成為可能。本文使用人胚胎干細(xì)胞，分別通過直接貼壁法和懸浮法誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，尋找效率、可行性更高的實(shí)驗(yàn)方案，為體外胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞更為深入的研究提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 干細(xì)胞來源 人胚胎干細(xì)胞來自于上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司X-01干細(xì)胞系。

1.2 主要試劑 DMEM/F12（Gibco SH30370.03），1%非必需氨基酸（Gibco），L-谷氨酰胺（Gibco），0.1mM β-巰基乙醇（Gibco），高糖 DMEM（Gibco），青鏈霉素（Gibco），絲裂霉素 C（Sigma），5%血清替代品SR（Gibco），普通胎牛血清 FBS（Gibco），干細(xì)胞專用胎牛血清 ES qualified FBS（Gibco 16141-061），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF Gibco HL20676），B27無血清添加劑（Gibco 17504-044），RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco 22400089），activin A（Gibco PHC9564），BMP4（Gibco），維生素 C，NaHCO3，PBS（Gibco），0.05%胰酶（Gibco），明膠，基質(zhì)膠（BD Pharmingen），膠原酶Ⅳ（Gibco），白血病抑制因子 LIF（Gibco）。

1.3 主要儀器 低速控溫離心機(jī)（Thermo Scientific CL10），高速控溫離心機(jī)（Thermo Pic017），液氮罐（Thermofisher YDS35HC35），電動(dòng)移液器（Thermo Scientific Finnpipette C1），CO2培養(yǎng)箱（Thermo，HERA cell150i），凍存管（NUNC），50mL/15mL 離心管（NUNC），6cm/10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿（NUNC），6孔板/24孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿（NUNC），低黏附性培養(yǎng)皿，超凈臺(tái)，顯微鏡，水浴鍋。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 人胚胎干細(xì)胞懸浮法制備EB以及分化 用200U/mL膠原酶Ⅳ370C處理人胚胎干細(xì)胞克隆10min后，挑起克隆轉(zhuǎn)移碎片到低黏附性培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)以形成擬胚體。4天后將擬胚體轉(zhuǎn)移到基質(zhì)膠處理過的6孔板中貼壁培養(yǎng)（1～3EBs/cm2），如結(jié)果中所需的時(shí)間分化成跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。

2.2 人胚胎干細(xì)胞加誘導(dǎo)劑的貼壁法分化 用200U/mL膠原酶Ⅳ370C處理人胚胎干細(xì)胞克隆10min后，以1×105個(gè)/cm2的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移到0.1%明膠處理過的培養(yǎng)皿中。用8ng/mL bFGF的條件培養(yǎng)基（人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)MEF細(xì)胞24h后的培基）培養(yǎng)6d后，更換為1640-B27培養(yǎng)基，同時(shí)用100ng/mL的人重組activin A處理24h，接著用10ng/mL的人重組BMP4處理4d，之后更換為不帶誘導(dǎo)劑的1640-B27培養(yǎng)基，每隔2～3d換1次培養(yǎng)基，持續(xù)2～3周。大量的自發(fā)跳動(dòng)心肌細(xì)胞在activin A加入后12d開始出現(xiàn)。

2.3 免疫熒光染色、膜片鉗實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞凋亡-Hoechst染色 在鋪有22mm×22mm蓋玻片的24孔板中，將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。然后經(jīng)過心肌細(xì)胞常規(guī)免疫熒光染色步驟處理；選擇有cTnT表達(dá)的跳動(dòng)心肌細(xì)胞用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用電流鉗技術(shù)記錄心肌細(xì)胞的自發(fā)性動(dòng)作電位。在三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)（5%CO2，95%N2）跳動(dòng)的心肌24h，刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后，使用Hoechst染色，再進(jìn)行流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)及多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)和免疫染色 光鏡下可見人胚胎干細(xì)胞克隆生長(zhǎng)形態(tài)及懸浮法誘導(dǎo)形成人胚胎干細(xì)胞擬胚體（EB）形態(tài)（見封三圖1）。分化培養(yǎng)7d左右，各組克隆開始出現(xiàn)跳動(dòng)的區(qū)域（有錄像保存）。胚胎干細(xì)胞分化為跳動(dòng)克隆后，經(jīng)免疫熒光染色心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物cTnT，可以看到幾乎整個(gè)克隆都呈陽性；通過膜片鉗實(shí)驗(yàn)，兩組跳動(dòng)心肌細(xì)胞均檢測(cè)到自發(fā)性動(dòng)作電位（見封三圖2）。

3.2 各組胚胎干細(xì)胞開始出現(xiàn)跳動(dòng)克隆的時(shí)間比較每組胚胎干細(xì)胞接種96個(gè)孔，每個(gè)孔1個(gè)EB。懸浮法組出現(xiàn)自發(fā)跳動(dòng)心肌細(xì)胞的平均時(shí)間為（13.9±0.9）天，貼壁法組出現(xiàn)自發(fā)跳動(dòng)心肌細(xì)胞的平均時(shí)間為（13.0±1.1）天，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見封三圖 3A。

3.3 各組胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化出現(xiàn)跳動(dòng)EB的平均頻率 懸浮法組出現(xiàn)自發(fā)跳動(dòng)心肌細(xì)胞的平均跳動(dòng)頻率為（63.8±5.6）次/分；貼壁法組出現(xiàn)自發(fā)跳動(dòng)心肌細(xì)胞的平均跳動(dòng)頻率為（63.0±7.0）次/分。兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見封三圖3B。

3.4 分化過程中兩組胚胎干細(xì)胞分化為跳動(dòng)克隆的數(shù)量比較 懸浮法組分化為跳動(dòng)克隆的百分比為20.8%，貼壁法組分化為跳動(dòng)克隆的百分比為66.7%，表明貼壁法誘導(dǎo)分化效率明顯高于懸浮法（P＜0.05）。見封三圖4。另外，誘導(dǎo)出現(xiàn)的跳動(dòng)心肌細(xì)胞維持跳動(dòng)的時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月以上。

3.5 各組心肌細(xì)胞凋亡比例 懸浮法組心肌細(xì)胞凋亡比例為（8.1±0.4）%，貼壁法組心肌細(xì)胞凋亡比例為（8.0±0.5）%。兩組凋亡比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見封三圖 3C、圖 5。

4 討論

人胚胎干細(xì)胞基因調(diào)控技術(shù)、體外誘導(dǎo)分化技術(shù)、移植技術(shù)、體內(nèi)擴(kuò)增技術(shù)等，均為現(xiàn)今各國(guó)專家研究的熱點(diǎn)[8-11]。

實(shí)驗(yàn)表明，與懸浮法比較，直接貼壁法誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的效率更高，所需時(shí)間也更短（P＜0.05），而兩組最后誘導(dǎo)出的心肌細(xì)胞在活性方面、抗凋亡能力方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但直接貼壁法用到的部分實(shí)驗(yàn)耗材，如activin A、BMP4、bFGF等相對(duì)比較昂貴，所以當(dāng)需要大量制備心肌細(xì)胞時(shí)這些成本必須要考慮在內(nèi)。而懸浮法誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞盡管分化效率較低，但是制備成本較低，也更加實(shí)用。兩種實(shí)驗(yàn)方法在分化為跳動(dòng)的心肌細(xì)胞所需時(shí)間上有一個(gè)共同點(diǎn)，就是前1周幾乎沒有跳動(dòng)的心肌細(xì)胞出現(xiàn)，從第2周左右開始呈爆發(fā)性指數(shù)式增長(zhǎng)，我們猜測(cè)是心肌細(xì)胞內(nèi)的肌蛋白纖維含量以及自律傳導(dǎo)系統(tǒng)大概需要2周左右的時(shí)間才能發(fā)育完全，最終產(chǎn)生心肌細(xì)胞的收縮。另外，直接貼壁法誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的步驟相對(duì)懸浮法雖然更為復(fù)雜，但具有進(jìn)一步優(yōu)化步驟的可能（如誘導(dǎo)因子劑量的調(diào)控、誘導(dǎo)因子培育的時(shí)間等），后續(xù)的試驗(yàn)將有可能進(jìn)一步提高其誘導(dǎo)分化效率，那么這種方法的價(jià)值也將更加凸顯。

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