近海魚類多樣性調(diào)查新方法—環(huán)境DNA分析技術(shù)

高天翔，陳 治，王曉艷

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東青島 266003）

傳統(tǒng)魚類多樣性調(diào)查方法具有諸多缺點(diǎn)[1-2]。近年來，以PCR、定量PCR及DNA條形碼技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合第二代高通量測(cè)序技術(shù)的環(huán)境DNA分析被廣泛地應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究中[3-6]。該方法直接從環(huán)境樣品中提取DNA，采用定量檢測(cè)、生物信息學(xué)分析等手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中所存在物種的有效檢測(cè)，在近海魚類多樣性調(diào)查方面具有重要的實(shí)際意義和良好的應(yīng)用前景。

1 環(huán)境DNA分析技術(shù)的概念及產(chǎn)生背景

生物多樣性是維持生態(tài)平衡、促進(jìn)人與自然和諧發(fā)展的重要成分，是生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的關(guān)鍵因素，也是生態(tài)系統(tǒng)對(duì)環(huán)境變化響應(yīng)與適應(yīng)的重要指標(biāo)。準(zhǔn)確掌握水生生物在水體環(huán)境中的生物量及其時(shí)空分布是開展水生生物物種多樣性保護(hù)的基本前提和重要基礎(chǔ)[3]。以往的魚類多樣性調(diào)查主要采用圍網(wǎng)、拖網(wǎng)、電魚等傳統(tǒng)研究方法[1-2,7-9]。這些調(diào)查方法普遍具有以下缺點(diǎn)：（1）調(diào)查費(fèi)用高、所需時(shí)間久。水生生物調(diào)查，不僅需要準(zhǔn)備網(wǎng)具、租賃船只，還需配備完整的調(diào)查人員和船舶駕駛?cè)藛T。燃油動(dòng)力費(fèi)及人員勞務(wù)費(fèi)亦是傳統(tǒng)資源調(diào)查難以縮減的開支。一般性的魚類多樣性調(diào)查，少則幾天，多則數(shù)年。費(fèi)用高、時(shí)間久是傳統(tǒng)調(diào)查方法的一個(gè)顯著缺點(diǎn)[8]。（2）目標(biāo)生物捕獲率低[8-9]。水生生物，尤其是以魚類為代表的水生游泳動(dòng)物，往往具有較強(qiáng)的游動(dòng)性，在水域出現(xiàn)的位置是不固定的。網(wǎng)具抓捕及魚群探測(cè)器調(diào)查的結(jié)果具有很大的不確定性。調(diào)查面積及探測(cè)范圍相對(duì)有限，水中魚類等亦能根據(jù)“視聽”等信息對(duì)網(wǎng)具和調(diào)查船只進(jìn)行規(guī)避性游動(dòng)。水域生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成復(fù)雜，有些物種因體型小、數(shù)量少、隱蔽性強(qiáng)等原因難以被抓獲，這使得魚類多樣性調(diào)查極為困難。因此調(diào)查結(jié)果往往不盡人意，基于傳統(tǒng)調(diào)查方法的海洋魚類捕獲率普遍偏低[8-9]。（3）物種鑒別困難[8]。傳統(tǒng)形態(tài)分類，需要專門的物種鑒別知識(shí)[10-11]。有些生物在特定的生長發(fā)育階段極難鑒定種屬，比如海洋魚類的幼魚及仔稚魚時(shí)期，一般人員很難對(duì)捕獲的漁獲物進(jìn)行準(zhǔn)確定種。（4）環(huán)境破壞性大[1-2]。拖網(wǎng)、圍網(wǎng)、電捕魚、實(shí)地考察等傳統(tǒng)方法搜集物種信息的方法，不僅對(duì)研究對(duì)象存在潛在傷害，而且對(duì)生物的棲息地環(huán)境存在程度不等的影響[8-9]。特別是拖網(wǎng)作業(yè)，對(duì)魚類賴以生存的水域生態(tài)環(huán)境破壞巨大，極易導(dǎo)致海底生境荒漠化[12]。

簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的物種多樣性調(diào)查新方法，是更好進(jìn)行水生生物監(jiān)測(cè)工作的一個(gè)難點(diǎn)。環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）分析技術(shù)，能夠有效克服傳統(tǒng)魚類多樣性調(diào)查方法的諸多缺點(diǎn)。環(huán)境DNA是生物體釋放于環(huán)境中的DNA總稱，主要來源于生物體的配子、皮膚碎屑、粘液或排泄物等[7]。從環(huán)境樣品（水體、土壤、空氣等）中直接提取DNA，不對(duì)任何目標(biāo)生物進(jìn)行分離，即監(jiān)測(cè)生物存在信息的這種方法，在20世紀(jì)80年代末首先應(yīng)用于微生物群落研究。隨后20年間，環(huán)境DNA分析法在土壤、凍土、淡水和海水等環(huán)境中的微生物群落多樣性和功能基因組研究中逐漸成型。

2 環(huán)境DNA分析技術(shù)的主要實(shí)現(xiàn)方法

環(huán)境DNA分析，主要通過PCR、定量PCR和高通量測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）技術(shù)實(shí)現(xiàn)[3-11]。PCR，特別是定量PCR可對(duì)單一目標(biāo)物種的存在、生物量及時(shí)空分布進(jìn)行檢測(cè)。無論是化石中的古生物、泥樣中的生物殘骸，還是水樣中所遺留的生物毛發(fā)、皮膚、粘液或血液，只要能分離出少許的環(huán)境DNA樣本，就能通過PCR加以放大，進(jìn)行分析。這正是環(huán)境DNA結(jié)合定量PCR技術(shù)的威力所在。普通PCR只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量；而且只能在反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)；電泳檢測(cè)的EB染液往往有毒[13]。而定量PCR技術(shù)，則擺脫了普通PCR技術(shù)的上述限制。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境樣本起始模板的定量分析[13]。qPCR技術(shù)因其快速、簡(jiǎn)易和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，目前被各實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。但qPCR技術(shù)所謂的“定量”仍然是相對(duì)的，依賴于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線。在目的序列含量低、表達(dá)量差異十分微小、反應(yīng)體系中含大量背景序列或抑制物等情況下，靈敏度和精確度都受到很大限制。數(shù)字PCR（dPCR）則是通過檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，最終根據(jù)泊松分布和熒光信號(hào)陽性的反應(yīng)單元占所有反應(yīng)單元的比例來直接計(jì)算目的核酸序列的拷貝數(shù)[13-14]。較qPCR技術(shù)有著高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對(duì)定量的四大優(yōu)勢(shì)[14]。無論是普通PCR或者定量PCR，都需要種間特異性高、種內(nèi)通用性強(qiáng)的擴(kuò)增引物，否則極易出現(xiàn)假陽性或者假陰性的錯(cuò)誤結(jié)果。兩種定量PCR技術(shù)都只能對(duì)單一目標(biāo)物種進(jìn)行特異性檢測(cè)。

傳統(tǒng)DNA條形碼技術(shù)是用基因組內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)化的DNA片段來鑒定生物物種的分子鑒定技術(shù)，已被廣泛用于物種快速鑒定及起源、進(jìn)化等研究領(lǐng)域[11]。但環(huán)境樣本中的DNA往往為許多物種的總DNA?；谝淮鷾y(cè)序技術(shù)的DNA條形碼分析和基于定量PCR分析的檢測(cè)手段無法對(duì)環(huán)境DNA進(jìn)行物種多樣性監(jiān)測(cè)研究。隨著第二代測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，DNA高通量條形碼（DNA metabarcoding）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，給環(huán)境DNA研究帶來了前所未有的革新[10,15]。DNA metabarcoding技術(shù)通過提取環(huán)境樣品中的DNA并使用條形碼基因通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，利用PCR和第二代測(cè)序等分子技術(shù)，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得可操作分類單元（operational taxonomic units,OTUs），通過與具有可靠物種分類信息的DNA條形碼參照序列進(jìn)行比對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的物種鑒定及目標(biāo)物種的信息獲取[16-17]。與PCR、定量PCR及傳統(tǒng)的DNA條形碼技術(shù)僅能從單一樣品中獲取DNA信息相比，DNA metabarcoding技術(shù)能夠直接從環(huán)境樣品或生物混合樣品中大批量識(shí)別物種，可對(duì)多物種進(jìn)行同步檢測(cè)，更加省時(shí)、高效、低成本，能夠滿足當(dāng)前生物多樣性快速評(píng)估的需求[18-19]。

3 環(huán)境DNA分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

及時(shí)、準(zhǔn)確掌握生物在環(huán)境中的分布、豐富度、群落形態(tài)是有效保護(hù)生物的基礎(chǔ)[20]。海洋占地球表面積的71%，種類繁多的海洋生物是生物多樣性研究的寶庫。但由于海洋生物種類繁多、生活空間廣闊，尤其是魚類幼體浮游生活期長、分布范圍內(nèi)不存在明顯地理屏障等，多數(shù)海洋魚類群體通常在較大的分布范圍內(nèi)遺傳分化很低，且其遺傳結(jié)構(gòu)在時(shí)間上具有不穩(wěn)定性[21-22]。因此，研究海洋生物物種多樣性和群體間相互關(guān)系等問題對(duì)于圍網(wǎng)、拖網(wǎng)、電魚等傳統(tǒng)生態(tài)學(xué)研究方法存在較大挑戰(zhàn)。同時(shí)，隨著環(huán)境變化和全球范圍內(nèi)過度捕撈的加劇，許多海洋魚類多樣性已嚴(yán)重衰退，種群崩潰現(xiàn)象日益嚴(yán)重。高營養(yǎng)級(jí)的大型魚類在漁獲物中所占比例下降，而小型魚類以及無脊椎動(dòng)物等低營養(yǎng)級(jí)生物比重逐漸上升[23]。采用傳統(tǒng)生態(tài)學(xué)調(diào)查方法，勢(shì)必會(huì)對(duì)物種本身及其棲息地環(huán)境造成一定程度的損害，客觀上加劇魚類多樣性的衰退速度。在海洋生態(tài)系統(tǒng)受損、食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)日趨簡(jiǎn)化、傳統(tǒng)調(diào)查方法捉襟見肘的大背景之下，利用環(huán)境DNA技術(shù)，特別是環(huán)境DNA metabarcoding方法評(píng)估海洋生物多樣性，量化分析關(guān)鍵種的資源豐富度，揭示其生態(tài)功能和作用，對(duì)指導(dǎo)海洋生物資源的保護(hù)及合理開發(fā)利用、探討生物適應(yīng)環(huán)境的遺傳學(xué)機(jī)制具有重要意義。

與傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，環(huán)境DNA分析技術(shù)具有以下顯著特點(diǎn)：（1）省時(shí)、省力、費(fèi)用低。對(duì)亞洲鯉魚Cyprinus carpio的研究，研究者采用電捕魚監(jiān)測(cè)法用時(shí)93 d，而eDNA技術(shù)只用了0.174 d[24]。對(duì)環(huán)境DNA分析所需要的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，只需幾升水而已，所以不需要特別專業(yè)的技術(shù)，普通人都可以簡(jiǎn)單地參與調(diào)查。既省去了船只租賃、人員勞務(wù)上的費(fèi)用，又節(jié)省了調(diào)查作業(yè)及后續(xù)物種鑒定所需的時(shí)間。（2）調(diào)查靈敏度高。YAMAMOTO，et al[25]利用環(huán)境DNA技術(shù)對(duì)日本舞鶴灣魚類多樣性進(jìn)行了調(diào)查，eDNA分析技術(shù)共檢測(cè)出128種海洋魚類。這128種海洋魚類中，有23種是過去14年采用傳統(tǒng)調(diào)查方法從未捕獲過的。表明環(huán)境DNA分析技術(shù)在海洋魚類檢測(cè)靈敏度上顯著高于傳統(tǒng)調(diào)查方法。（3）環(huán)境友好、對(duì)調(diào)查對(duì)象無損傷[1,9]。eDNA分析技術(shù)，需要的是水樣、底泥、空氣等環(huán)境樣本，不需要對(duì)調(diào)查對(duì)象進(jìn)行直接抓捕。水樣及泥樣的獲取，僅需一部采水器或采泥器即可。與拖網(wǎng)作業(yè)等調(diào)查方法相比，最大限度減少了對(duì)調(diào)查生境的破壞。

4 環(huán)境DNA分析技術(shù)的應(yīng)用

4.1 國外應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來，國外已成功將環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)植物的多樣性監(jiān)測(cè)研究，基于環(huán)境DNA技術(shù)的水生生物研究文獻(xiàn)也越來越多，2016年發(fā)表論文近百篇。目前這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物多樣性評(píng)價(jià)、水生生物監(jiān)測(cè)和珍稀瀕危物種保護(hù)等研究領(lǐng)域[8-10]。

WILLERSLEV，et al[26]首次利用環(huán)境DNA分析法揭示了沉積物中滅絕的植物、哺乳動(dòng)物及鳥類的物種組成的多樣性，標(biāo)志著環(huán)境DNA分析在生物學(xué)研究中的應(yīng)用從低等的微生物擴(kuò)展至高等的動(dòng)植物。2008年FICETOLA，et al[7]將這一技術(shù)引入水生生物研究領(lǐng)域，利用水中提取的DNA來監(jiān)測(cè)美國牛蛙Rana catesbeiana的分布狀況，開啟了水生生物實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)應(yīng)用研究。THOMSEN，et al[27]首次嘗試?yán)铆h(huán)境DNA技術(shù)對(duì)研究水域中某些瀕危物種生物量進(jìn)行估測(cè)。隨后JERDE，et al[24]利用水樣環(huán)境DNA分析法監(jiān)測(cè)了密歇根湖及其周邊河流中鰱Hypophthalmichthys molitrix和鳙H.nobilis的擴(kuò)散趨勢(shì)，結(jié)果表明這2種入侵魚的分布范圍已經(jīng)超出了傳統(tǒng)調(diào)查法劃定的區(qū)域，為入侵物種的治理工作提供了準(zhǔn)確的位置信息和預(yù)警資料。2013年，TAKAHARA，et al[28]利用eDNA技術(shù)追蹤入侵物種—藍(lán)鰓太陽魚Lepomis macrochirus在日本本土及周邊島嶼的擴(kuò)散趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)環(huán)境DNA研究結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)資源調(diào)查結(jié)果。2015年，SIGSGAARD，et al[29]利用環(huán)境DNA分析技術(shù)，成功地從傳統(tǒng)分布區(qū)內(nèi)檢測(cè)到了歐洲泥鰍Misgurnus fossilis的蹤跡，為物種保護(hù)補(bǔ)充了重要的地理分布信息。

2016年，SIGSGAARD，et al[30]利用環(huán)境DNA技術(shù)開展了世界上體型最大的魚類—鯨鯊Rhincodon typus的種群遺傳學(xué)研究，推算育齡雌性鯨鯊的數(shù)量約有71000頭，并認(rèn)為出沒在埃爾沙辛油田海域的鯨鯊種群和印度洋—太平洋種群更為接近，該研究結(jié)果被評(píng)價(jià)為具有劃時(shí)代意義的“概念性進(jìn)步”，“將環(huán)境DNA的研究推上了一個(gè)新高度”。DOI，et al[31]研究了佐波川河環(huán)境DNA濃度與香魚Plecoglossus altivelis的生物量關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)境DNA技術(shù)是評(píng)估香魚生物量及其空間分布的有效手段。近幾年，人們也開展了兩棲類[32-34]、甲殼類[35-36]、軟體動(dòng)物[37]等水生動(dòng)物研究，進(jìn)一步證實(shí)了環(huán)境DNA研究的有效性和可靠性。

除了用環(huán)境DNA定量檢測(cè)特定物種外，THOMSEN，et al[27]通過metabarcoding測(cè)序技術(shù)，對(duì)歐洲多國淡水系統(tǒng)的瀕危水生動(dòng)物（魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類、昆蟲）進(jìn)行多樣性檢測(cè)，研究結(jié)果一方面支持環(huán)境DNA在水體環(huán)境的廣泛分布性，另一方面證明metabarcoding技術(shù)對(duì)不同生物分類群具有普遍適用性，能夠可靠用于珍稀和瀕危物種監(jiān)測(cè)。YAMAMOTO，et al[25,36]通過日本海舞鶴灣魚類分布和環(huán)境DNA關(guān)系分析，結(jié)合網(wǎng)格化調(diào)查和聲學(xué)評(píng)估手段，得出表層水體環(huán)境DNA濃度與生物量調(diào)查結(jié)果呈顯著正相關(guān)的結(jié)論，認(rèn)為環(huán)境DNA濃度不僅可反映竹莢魚Trachurus japonicus生物量，而且在海洋魚類多樣性檢測(cè)靈敏度、結(jié)果可信度等方面均顯著高于傳統(tǒng)調(diào)查方法。

4.2 國內(nèi)應(yīng)用探討——以舟山漁場(chǎng)為例

國內(nèi)關(guān)于環(huán)境DNA技術(shù)研究水生生物的研究很少，僅有三例相關(guān)報(bào)道[8-9]。馬竹欣[38]采用環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測(cè)了克氏原螯蝦Procambarus clarkii在元陽梯田的分布狀況和擴(kuò)散動(dòng)態(tài)，為這一外來入侵物種的防控提供了決策依據(jù)。徐念等[39]開展了長江中下游干流環(huán)境DNA分析工作，共獲得了10種魚類序列，為長江水生珍稀瀕危物種監(jiān)測(cè)和多樣性評(píng)價(jià)提供了基礎(chǔ)依據(jù)。姜維等[40]開展了以川陜哲羅鮭Hucho bleekeri為目標(biāo)物種的水樣環(huán)境DNA分析流程的優(yōu)化工作，認(rèn)為線粒體DNA控制區(qū)可作為鑒定川陜哲羅鮭的特異性分子標(biāo)記。目前，eDNA分析技術(shù)在海洋魚類多樣性研究進(jìn)展十分迅速，而我國相關(guān)研究報(bào)道幾乎是空白。對(duì)于典型海域、典型漁場(chǎng)，國內(nèi)缺乏環(huán)境DNA技術(shù)的應(yīng)用研究。

舟山漁場(chǎng)是我國最大的近海漁場(chǎng)，位處長江、錢塘江、甬江等河流的入海交匯區(qū)，東部受臺(tái)灣暖流的影響，西部主要受由三江等大陸徑流形成的沿岸水影響，北部還有黃海冷水團(tuán)的季節(jié)性分布，形成獨(dú)特的水文環(huán)境。加上舟山海域上千個(gè)島嶼的分布，使其自然環(huán)境優(yōu)越、餌料豐富，是眾多經(jīng)濟(jì)魚類、蝦蟹類等多種水生動(dòng)物的產(chǎn)卵繁殖和索餌育肥的好場(chǎng)所[41-42]，也是開展環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用研究的理想水域。雖然舟山漁場(chǎng)魚類物種豐富、生物多樣性高，但圍繞魚類資源的系統(tǒng)研究一直落后于漁業(yè)生產(chǎn)。有關(guān)舟山海域魚類的明確記載，最早見于1994年毛錫林、蔣文波先生主編的《舟山海域海洋生物志》[41]，共列出舟山海域魚類名錄317種，對(duì)其中68種魚類的形態(tài)、分布、經(jīng)濟(jì)價(jià)值做了簡(jiǎn)單描述。此后，其他學(xué)者根據(jù)新的發(fā)現(xiàn)和資料，從不同角度陸續(xù)予以了補(bǔ)充。1995年《舟山魚類多樣性調(diào)查和漁業(yè)區(qū)劃》（未公開發(fā)表）中一共記載了365種魚類，但未見具體魚類名錄。趙盛龍等[42]根據(jù)2000年4月至2005年4月采集的舟山海域魚類標(biāo)本，結(jié)合標(biāo)本館、研究所等現(xiàn)有標(biāo)本的復(fù)查，以及有關(guān)文獻(xiàn)資料的核查，編著了《舟山海域魚類原色圖鑒》，該圖鑒匯集了該海域魚類467種（其中6種為國內(nèi)外引進(jìn)種），并簡(jiǎn)要敘述了其形態(tài)特征、習(xí)性、利用和分布。2006年以后，有較多關(guān)于浙江沿海魚類新種和新紀(jì)錄種的報(bào)道。GAO，et al[43]通過形態(tài)特征和DNA條形碼研究，報(bào)道了鱚屬魚類新種—中國鱚Sillago sinica。一些新紀(jì)錄種如大口鯊Megachasma pelagios[44]、前肛臀棘鯛Paratrachichthys prosthemius[45]、長木葉鰈Pleuronichthys japonicus[46]等也相繼在舟山海域發(fā)現(xiàn)并描述。2012年4-7月，陳健等[47]在舟山海域采獲3種新紀(jì)錄魚類—平頭竿蝦虎魚Luciogobius platycephalus、日本長鱸Liopropoma japonicum、黑體網(wǎng)鳚Dictyosoma burgeri。同時(shí)，歷史上舟山漁場(chǎng)曾以盛產(chǎn)大黃魚Larimichthys crocea、小黃魚L.polyactis、帶魚Trichiurus lepturus、曼氏無針烏賊Sepiella japonica等四大海產(chǎn)而聞名。但由于捕撈過度和海洋環(huán)境污染的加劇，大黃魚和烏賊資源嚴(yán)重衰退已近枯竭[48-49]。

由此可見，舟山海域到底有多少種魚類？其資源分布及其特性如何？巨大的捕撈壓力和人類活動(dòng)影響下，魚類生物多樣性受到何種程度的威脅？該海域重要經(jīng)濟(jì)魚種的又有何現(xiàn)狀和特點(diǎn)？亟需深入研究。而以往的海洋魚類多樣性研究主要采用圍網(wǎng)、拖網(wǎng)、電魚等傳統(tǒng)調(diào)查方法。具有目標(biāo)生物捕獲率低、物種鑒別困難、環(huán)境破壞性大、調(diào)查過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺陷[1-11]。同時(shí)，舟山海域有1 390個(gè)島嶼，星羅密布的島嶼更大大限制了舟山近海魚類多樣性的常規(guī)監(jiān)測(cè)，島礁密布區(qū)常常無法開展魚類多樣性拖網(wǎng)調(diào)查。以舟山近海為案例，采用環(huán)境友好、采樣簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確的環(huán)境DNA分析技術(shù)，對(duì)魚類生物多樣性及其資源量評(píng)估進(jìn)行研究意義重大。

首先，舟山海域水體泥沙含量高、水體渾濁度大。獨(dú)特的水文環(huán)境導(dǎo)致eDNA的提取具有很大的難度[39]。亟待明確影響環(huán)境DNA提取效果的主要因素，確立受河口影響渾水區(qū)水樣的最適eDNA提取方法。在該海域開展高質(zhì)量eDNA的提取方法的探索實(shí)驗(yàn)，具有很大的代表性和針對(duì)性?？刹捎贸恋砗统闉V等方法相結(jié)合的方式獲取海水中的eDNA，同時(shí)采集底泥來獲取底泥中eDNA，通過控制變量和多重交叉方案同步進(jìn)行，探索舟山近海水樣eDNA提取過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并對(duì)提取的水樣環(huán)境DNA進(jìn)行核酸定量分析，結(jié)合絕對(duì)定量PCR檢測(cè)，確定適用于舟山近海的高質(zhì)量環(huán)境DNA提取方法[13-14]。

其次，大黃魚、小黃魚、帶魚和墨魚（曼氏無針烏賊）曾為舟山漁場(chǎng)的四大漁產(chǎn)[48-49]。20世紀(jì)70年代以來由于大批機(jī)動(dòng)漁船輪番濫捕等原因，先后出現(xiàn)生長型和補(bǔ)充型群體數(shù)量減少過度，典型經(jīng)濟(jì)魚類資源嚴(yán)重衰退的現(xiàn)象[48-49]?；诃h(huán)境DNA技術(shù)對(duì)特定海洋魚種的生物量監(jiān)測(cè)工作在國內(nèi)還處于萌芽期。若能結(jié)合養(yǎng)殖場(chǎng)的大、小黃魚、曼氏無針烏賊等物種的繁育工作，對(duì)養(yǎng)殖水體eDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，通過eDNA拷貝數(shù)與物種豐富度或密度進(jìn)行回歸關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步建立實(shí)驗(yàn)室水體eDNA濃度與生物量或豐度關(guān)系模型，并結(jié)合野外魚類多樣性調(diào)查數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行有效性驗(yàn)證分析，則不僅有望定量評(píng)價(jià)四大漁產(chǎn)資源豐度及其在舟山島礁海域時(shí)空分布，同時(shí)可為其他物種的生物量相關(guān)研究提供技術(shù)參考。

最后，環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)在時(shí)間和資金成本上優(yōu)于傳統(tǒng)調(diào)查方法，在減少海上調(diào)查成本、克服普通PCR和定量PCR只能對(duì)單一物種檢測(cè)的同時(shí)，不僅對(duì)水體中的全部海洋生物可進(jìn)行同步檢測(cè)，還可以從種群密度很低的環(huán)境樣本中靈敏地檢測(cè)到物種的存在，增加發(fā)現(xiàn)新種、隱存種或者稀有物種的可能性，為生物多樣性保護(hù)和管理工作提供更為客觀、全面的本底資料[3-12,24-25]。采用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)，開展海洋生物多樣性及時(shí)空分布監(jiān)測(cè)，進(jìn)行舟山海域魚類的準(zhǔn)確、快速鑒定，可實(shí)現(xiàn)對(duì)舟山近海水生生物的有效調(diào)查，簡(jiǎn)便且高效地闡明其生物多樣性（包括種類組成和生物量分布）。結(jié)合不同季節(jié)的魚類資源海上大面調(diào)查，雙向驗(yàn)證舟山海域魚類的多樣性及其時(shí)空分布狀況。如果同步采用GIS技術(shù)，則能更好地實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)工作，建立一套完善的近海河口生物eDNA metabarcoding分析流程。研究結(jié)果不僅可以探索適用于舟山島礁海域漁業(yè)多樣性的環(huán)境DNA調(diào)查方法，為現(xiàn)有監(jiān)測(cè)研究提供新的技術(shù)手段，也將為后續(xù)魚類多樣性調(diào)查評(píng)估及其保護(hù)管理提供技術(shù)支撐。

5 環(huán)境DNA分析技術(shù)展望

與傳統(tǒng)生物多樣性研究方法相比，環(huán)境DNA技術(shù)具有環(huán)境友好、靈敏度高、省時(shí)省力、對(duì)調(diào)查對(duì)象無損傷等優(yōu)點(diǎn)。環(huán)境DNA分析技術(shù)應(yīng)用于近海魚類多樣性評(píng)估，不僅能夠更全面地揭示魚類多樣性及其時(shí)空變化規(guī)律，評(píng)估重要經(jīng)濟(jì)魚種生物量的時(shí)空分布，發(fā)現(xiàn)并描述新發(fā)現(xiàn)種類，為魚類多樣性的持續(xù)利用、保護(hù)與管理提供基礎(chǔ)資料，也將為其他水生生物資源調(diào)查研究提供參考，具有重要的實(shí)踐意義和良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙盛龍,王日昕,劉緒生.舟山漁場(chǎng)大黃魚資源枯竭原因及保護(hù)和增殖對(duì)策[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2002,21(2):160-165.

[2]苗振清.浙江南部外海魚類多樣性可持續(xù)利用研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2009:25-28.

[3]LODGE D M,TURNER C R,JERDE C L,et al.Conservation in a cup of water:estimating biodiversity and population abundance from environmental DNA[J].Molecular Ecology,2012,21(11):2 555-2 558.

[4]THOMSEN P F,KIELGAST J,IVERSEN L L,et al.Monitoring endangered freshwater biodiversity using environmental DNA[J].Molecular Ecology,2012,21(11):2 565-2 573.

[5]BOHMANN K,EVANS A,GILBERT M T P,et al.Environmental DNA for wildlife biology and biodiversity monitoring[J].Trends in Ecology＆Evolution,2014,29(6):358-367.

[6]WILLERSLEV E,HANSEN A J,BINLADEN J,et al.Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments[J].Science,2003,300(5620):791-795.

[7]FICETOLA G F,MIAUD C,POMPANON F,et al.Species detection using environmental DNA from water samples[J].Biology Letters,2008,4(4):423-425.

[8]姜維,趙虎,鄧捷,等.環(huán)境DNA分析技術(shù)——一種水生生物調(diào)查新方法[J].水生態(tài)學(xué)雜志,2016,37(5):1-7.

[9]馬鴻娟,KATHRYN S,馬利民,等.環(huán)境DNA及其在水生生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)中的應(yīng)用[J].生態(tài)學(xué)雜志,2016,35(2):516-523.

[10]陳 煉,吳 琳,劉 燕,等.環(huán)境DNA metabarcoding及其在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(15):4 573-4 582.

[11]HEBERT P D N,CYWINSKA A,BALL S L,et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings the Royal of Society B:Biology Science,2003,270(1521):313-321.

[12]孫中之,許傳才,周 軍,等.黃渤海區(qū)拖網(wǎng)漁業(yè)現(xiàn)狀與分析[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2013,40(1):50-55.

[13]毛 賀.定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)熒光檢測(cè)技術(shù)研究[D].杭州:浙江大學(xué),2015:37-39.

[14]詹 成,燕 麗,王 琳,等.數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用[J].復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2015,42(6):786-789.

[15]VALENTINI A,TABERLET P,MIAUD C,et al.Next-generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding[J].Molecular Ecology,2016,25(4):929-942.

[16]KUMAR S,CARLSEN T,MEVIK B H,et al.CLOTU:an online pipeline for processing and clustering of 454 amplicon reads into OTUs followed by taxonomic annotation[J].BMC Bioinformatics,2011,12(3):182-187.

[17]JI Yinqiu,ASHTON L,PEDLEY S M,et al.Reliable,verifiable and efficient monitoring of biodiversity via metabarcoding[J].Ecology Letters,2013,16(10):1 245-1 257.

[18]SHAWA J L A,CLARKE L J,WEDDERBUM S D,et al.Comparison of environmental DNA metabarcoding and conventional fish survey methods in a river system[J].Biological Conservation,2016,197(4):131-138.

[19]AYLAGAS E,BORJA A,IRIGOIEN X,et al.Benchmarking DNA metabarcoding for biodiversity-based monitoring and as sessment[J].Frontiers in Marine Science,2016,1(3):557-568.

[20]LODGE D M,TURNER C R,JERDE C L,et al.Conservation in a cup of water:estimating biodiversity and population abundance from environmental DNA[J].Molecular Ecology,2012,21(11):2 555-2 558.

[21]DeWOODY J A,AVISE J C.Microsatellite variation in marine,freshwater and anadromous fishes compared with other animals[J].Journal of Fish Biology,2000,56(3):461-473.

[22]HOGAN J D,THIESSEN R J,HEATH D D.Variability in connectivity indicated by chaotic genetic patchiness within and among populations of a marine fish[J].Marine Ecology Progress Series,2010,417(6):263-275.

[23]ALDER J,CAMPBELL B,KARPOUZI V,et al.Forage fish:from ecosystems to markets[J].Annual Review of Environment&Resources,2008,33(33):153-166.

[24]JERDE C L,CHADDERTON W L,MAHON A R,et al.Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program[J].Canadian Journal of Fisheries&Aquatic Sciences,2013,70(4):522-526.

[25]YAMAMOTO S,MASUDA R,SATO Y,et al.Environmental DNA metabarcoding reveals local fish communities in a speciesrich coastal sea[J].Scientific Reports,2017,7(4):40368.DOI:10.1038/srep40368

[26]WILLERSLEV E,HANSEN A,BINLADEN J,et al.Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments[J].Science,2003,300(4):791-795.

[27]THOMSEN P F,KIELGAST J,IVERSEN L L,et al.Monitoring endangered freshwater biodiversity using environmental DNA[J].Molecular Ecology,2012,21(12):2 565-2 672.

[28]TAKAHARA T,MINAMOTO T,DOI H.Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds[J].PLoS One,2013,8(2):e56584.DOI:10.1371/journal.pone.0056584

[29]SIGSGAARD E E,CARL H,MOLLER P R,et al.Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples[J].Biological Conservation,2015,183(11):46-52.

[30]SIGSGAARD E E,NIELSEN I B,BACH S S,et al.Population characteristics of a large whale shark aggregation inferred from seawater environmental DNA[J].Nature Ecology&Evolution,2016,1(1):4-17.

[31]DOI H,INUI R,AKAMATSU Y,et al.Environmental DNA analysis for estimating the abundance and biomass of stream fish[J].Freshwater Biology,2017,62(1):30-39.

[32]PILLIOD D,GOLDBERG C S,ARKLE R S,et al.Estimating occupancy and abundance of stream amphibians using environmental DNA from filtered water samples[J].Canadian Journal of Fisheries&Aquatic Sciences,2013,70(8):1 123-1 130.

[33]FUKUMOTO S,USHIMARU A,MINAMOTO T.A basin-scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers:a case study of giant salamanders in Japan[J].Journal of Applied Ecology,2015,52(2):358-365.

[34]TREGUIER A,PAILLISSON J M,DEJEAN T,et al.Environmental DNA surveillance for invertebrate species:advantages and technical limitations to detect invasive crayfish Procambarus clarkiiin freshwater ponds[J].Journal of Applied Ecology,2014,51(6):871-879.

[35]GOLDBERG C S,SEPULVEDA A,RAY A,et al.Environmental DNA as a new method for early detection of New Zealand mudsnails(Potamopyrgus antipodarum)[J].Freshwater Science,2013,32(3):792-800.

[36]DEINER K,ALTERMATT F.Transport distance of invertebrate environmental DNA in a natural river[J].PLoS One,2014,9(2):e88786.DOI:10.1371/journal.pone.0088786.

[37]YAMAMOTO S,MINAMI K,FUKAYA K,et al.Environmental DNA as a ｀snapshot＇of fish distribution:a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay,Sea of Japan[J].PLoS One,2016,11 (4):e0149786.DOI：10.1371/journal.pone.0149786

[38]馬竹欣.利用環(huán)境DNA技術(shù)調(diào)查入侵種克氏原螯蝦在元陽梯田的分布[D].昆明:云南大學(xué),2016.

[39]徐 念,常劍波.長江中下游干流環(huán)境DNA樣本魚類物種檢測(cè)的初步研究[J].水生態(tài)學(xué)雜志,2016,37(5):49-55.

[40]姜 維,王啟軍,鄧 捷,等.以川陜哲羅鮭為目標(biāo)物種的水樣環(huán)境DNA分析流程的優(yōu)化[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2016,27(7):2 372-2 378.

[41]普陀縣志編輯部.舟山海域海洋生物志[M].杭州:浙江人民出版社,1994.

[42]趙盛龍,鐘俊生.舟山海域魚類原色圖鑒[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2006.

[43]GAO Tian-xiang,JI Dong-ping,XIAO Yong-shuang,et al.Description and DNA barcoding of a new Sillago species,Sillago sinica(Perciformes:Sillaginidae),from coastal waters of China[J].Zoological Studies,2011,50(2):254-263.

[44]王火根,范忠勇,方一峰.中國大陸沿海鯊魚新紀(jì)錄種[J].動(dòng)物分類學(xué)報(bào),2007,32(2):490-491.

[45]林龍山,程家驊,高天翔.東海中部臀棘鯛屬魚類新紀(jì)錄種[J].海洋水產(chǎn)研究,2007,28(6):80-82.

[46]張 輝,高天翔,徐漢祥,等.中國木葉鰈屬魚類一新紀(jì)錄種[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2011,41(增刊):51-54.

[47]陳 健,趙盛龍.浙江海域3種魚類新紀(jì)錄[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,31(5):379-383.

[48]趙盛龍,陳 健,余法建.浙江海洋魚類種類組成、區(qū)系分布及資源特征研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,31(1):1-11.

[49]寧 平,俞存根,虞聰達(dá),等.浙江外海漁場(chǎng)魚類區(qū)系特征研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,27(3):266-270.