Nogo蛋白與周圍神經(jīng)再生

賈波 黃偉 王天兵

周圍神經(jīng)損傷修復(fù)是醫(yī)學(xué)科學(xué)的難題，即使應(yīng)用了精細的顯微外科技術(shù)，功能恢復(fù)還是不能令人滿意。如何加快損傷后神經(jīng)再生修復(fù)，是當(dāng)前神經(jīng)損傷研究領(lǐng)域內(nèi)的一個重要課題。Nogo家族是由—Reticulon—4基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其在神經(jīng)損傷再生中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。針對Nogo蛋白家族相關(guān)成員及其對神經(jīng)再生的影響和機制，現(xiàn)就目前的文獻資料作一述評。

一、Nogo蛋白基本情況

Nogos（neurite—outgrowth—inhibitor—proteins）最早因其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中強烈的抑制神經(jīng)再生作用而被發(fā)現(xiàn)。為了研究神經(jīng)再生抑制因素，Caroni與Spillmann相繼發(fā)現(xiàn)對神經(jīng)突生長具有強烈抑制作用的同源性蛋白NI，其特異性單克隆抗體可中和髓磷脂對軸突再生的抑制作用［1-2］。最終，Chen—等從大鼠cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了編碼該蛋白的基因，并將其正式命名為Nogo［3］。Nogo主要位于真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其蛋白C端均含有網(wǎng)狀蛋白同源域，因其又是網(wǎng)狀蛋白家族（reticulon—protein—family，Rtn）的一員，故被稱為Rtn4。

由于啟動子和剪切方式的不同，哺乳動物的nogo基因主要有三個轉(zhuǎn)錄本：Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C。其中Nogo-A/B的轉(zhuǎn)錄由啟動子1負責(zé)。Nogo-C的轉(zhuǎn)錄則由啟動子2負責(zé)。三種Nogo蛋白的氨基端沒有同源性，也沒有通常作為信號肽的疏水區(qū)，但它們有相同的羧基端。羧基端由188個氨基酸組成，包含66個氨基酸組成的親水結(jié)構(gòu)域（Nogo66）和兩個疏水結(jié)構(gòu)域。Nogo66是3種Nogo蛋白共同的氨基酸序列，正是由于這66個氨基酸殘基的存在,才使Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C都具有神經(jīng)抑制活性［4］。另外羧基端有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號，因此Nogo主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。但Dana—等發(fā)現(xiàn)Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C位于數(shù)種細胞株的質(zhì)膜表面，并且不同的轉(zhuǎn)錄本在多種不同細胞株中可形成復(fù)合體并相互作用［5］。同時，Nogo-A的氨基端以及羧基端均可以暴露在細胞膜表面發(fā)揮抑制軸突再生的作用［4］。因此，Nogo并非僅僅位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并在胞內(nèi)發(fā)揮作用，還可影響細胞外的其他細胞。

二、Nogo-A與周圍神經(jīng)再生

Nogo-A主要表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)而不表達于周圍神經(jīng)［6］，但在促神經(jīng)再生能力更強的周圍神經(jīng)環(huán)境中，Nogo-A同樣可以發(fā)揮出強烈的抑制神經(jīng)生長作用。其在周圍神經(jīng)的研究主要有三方面：（1）坐骨神經(jīng)再生：在小鼠雪旺細胞中轉(zhuǎn)入Nogo-A后，與正常去神經(jīng)支配的坐骨神經(jīng)相比，其表達減慢了軸突生長速率，小鼠下肢運動功能恢復(fù)明顯變差［7］。（2）對背根神經(jīng)節(jié)的影響：給予小鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal—root—ganglia，DRG）Nogo-A特異性中和抗體處理，處理組比對照組DRG生長出更粗壯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)神經(jīng)突，并且神經(jīng)束的分支顯著減少，小鼠背根神經(jīng)的生長和功能增強在抑制Nogo-A后得到增強［8］。（3）周圍神經(jīng)移植：在玻璃體內(nèi)坐骨神經(jīng)移植有助于大鼠視神經(jīng)的再生，而這種再生與雪旺細胞衍生因子誘導(dǎo)NgR和Nogo-A蛋白降解有關(guān)［9］。

與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相比，周圍神經(jīng)系統(tǒng)對軸突有更好的促再生環(huán)境，其多種相互作用的再生因子更有利于神經(jīng)的再生，而將Nogo-A作為一種有效的神經(jīng)突生長抑制劑則可以超越已知存在于損傷的外周神經(jīng)中的多種強烈的再生增強因子，抑制周圍神經(jīng)的再生［7］。

Nogo-A具有兩個重要結(jié)構(gòu)域，分別為位于氨基端的Nogo-A特異性結(jié)構(gòu)域amino-nogo和位于羧基端的Nogo蛋白同源結(jié)構(gòu)域Nogo66。Nogo-A與NgR結(jié)合抑制軸突再生的作用可以通過Nogo66完成，Nogo66通 過 與NgR、p75TRN/troy、Lingo-1等形成的復(fù)合物受體結(jié)合將抑制信號傳入軸突內(nèi)［10］，經(jīng)過了ROCK激酶激發(fā)肌動蛋白解聚從而活化下游RhoA，導(dǎo)致生長錐塌陷，發(fā)揮抑制軸突再生作用［11］。Amino-nogo比Nogo66的抑制作用更加廣泛［12］，它可以抑制脊根神經(jīng)節(jié)軸突和小腦顆粒細胞軸突生長以及成纖維細胞的擴散。然而，目前對作用其機制仍需要進一步探索，amino-nogo和nogo66均可以獨立發(fā)揮抑制軸突再生的作用，而amino-nogo的存在或許正是Nogo-A對軸突的作用可以強于其他Nogo蛋白的原因。也正是它的存在讓我們發(fā)現(xiàn)Nogo-A對于神經(jīng)的抑制途徑是多方面的，它并不僅僅作用于軸突生長錐，還可以通過影響神經(jīng)內(nèi)成纖維細胞的遷移來影響軸突的生長。這也給我們的研究打開了另一扇大門。

三、Nogo-B與周圍神經(jīng)再生

與Nogo-A不同，Nogo-B在全身各組織廣泛表達且功能具有多樣性［13］，主要調(diào)節(jié)血管重塑［14］和細胞凋亡過程。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中Nogo-B大量表達在雪旺細胞，在神經(jīng)元內(nèi)則表達較低。它的調(diào)節(jié)凋亡作用在損傷神經(jīng)雪旺細胞內(nèi)活躍進行，大鼠坐骨神經(jīng)橫切后1周，在損傷點附近的雪旺細胞中出現(xiàn)明顯增加的Nogo-B蛋白切割現(xiàn)象，不同于經(jīng)典的caspase-3調(diào)控方式，該切割過程主要受caspase-7的調(diào)控［15］。然而該過程與周圍神經(jīng)的修復(fù)功能是否相關(guān)則需要進一步的探索。其他關(guān)于Nogo-B在周圍神經(jīng)再生中發(fā)揮作用的研究主要有兩方面：（1）Nogo-B大量表達在雪旺細胞，主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞質(zhì)膜，而不存在于髓鞘內(nèi);（2）Nogo-B—/—NgBR信號軸可以調(diào)控軸突分支數(shù)量。敲除雪旺細胞Nogo-B的表達或阻斷其神經(jīng)元受體NgBR可以導(dǎo)致感覺神經(jīng)元的軸突分支數(shù)量明顯減少，但軸突長度不受影響［16］。

敲減后，Nogo-B與Nogo-A對于神經(jīng)的作用有相似之處，都可以減少神經(jīng)再生軸突的分支數(shù)量而不影響神經(jīng)再生的長度，這使得再生的神經(jīng)更加粗壯，功能更加活躍。已經(jīng)證實，Nogo-B所調(diào)控的軸突分支數(shù)量減少的作用并非由Nogo66介導(dǎo)完成。因為使用Nogo66拮抗肽NEP1-40可抑制Nogo66與NgBR受體的結(jié)合，卻并沒有改變Nogo-B對軸突數(shù)量的調(diào)控作用。通過干預(yù)AmNogo-B或許可以阻斷Nogo-B對軸突分支數(shù)量的調(diào)節(jié)作用，卻需要進一步證實。Nogo-A或許也存在與AmNogo-B功能相近的結(jié)構(gòu)域來發(fā)揮這一作用，如果有的話，它是否與amino-nogo有關(guān)，對于這一問題的研究，將有助于我們進一步認識Nogo蛋白的作用機制，對于Nogo蛋白家族各成員之間的相互聯(lián)系和相互作用也必然會有更深入的發(fā)現(xiàn)。

另一方面，過表達后的Nogo-B是通過雪旺細胞的凋亡途徑來影響神經(jīng)再生，或是與Nogo-A一樣可以誘導(dǎo)生長錐的塌陷，目前也尚未有研究證實。

四、Nogo-C與周圍神經(jīng)再生。

Nogo-C在全身組織多處都有表達，最多表達于骨骼肌中。目前關(guān)于Nogo-C的研究多集中在其促進細胞凋亡的作用，它可以促進心肌梗死中發(fā)生的心肌細胞凋亡［17］，抑制Nogo-C的表達則可以保護心肌細胞。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，Kim等在小鼠雪旺細胞內(nèi)過表達Nogo-C，發(fā)現(xiàn)其對周圍神經(jīng)再生發(fā)揮抑制作用［18］，但其抑制神經(jīng)再生的機制是否涉及細胞凋亡有待于進一步探究。

五、Nogo受體（Nogo—receptor，NgR）

NgR是在髓鞘中發(fā)現(xiàn)的三種軸突生長抑制分子—Nogo-A，髓鞘相關(guān)糖蛋白和少突膠質(zhì)細胞髓鞘糖蛋白的常見受體［19］。目前普遍認為NgR在引起生長錐塌陷和抑制神經(jīng)軸突生長中具有重要作用［19-20］。它可以結(jié)合Nogo蛋白，與p75TRN、Lingo-1等結(jié)合形成配體/受體復(fù)合物，經(jīng)由RhoA途徑介導(dǎo)軸突再生抑制作用。

此外，NgR還表達在巨噬細胞，參與介導(dǎo)周圍神經(jīng)損傷后髓鞘和軸突的崩解過程［21］。周圍神經(jīng)損傷后的Wallerian變性過程需要巨噬細胞參與吞噬遠端損傷的軸突和髓鞘，在此過程中，巨噬細胞必須進入雪旺細胞基底層，Wallerian變性結(jié)束后，巨噬細胞需再從雪旺細胞基底層遷出，進入血管從而離開神經(jīng)［22］。NgR在與髓鞘存在時可以抑制巨噬細胞與髓鞘之間的結(jié)合。在坐骨神經(jīng)損傷后，軸突中的NgR表達迅速下調(diào)，但在損傷神經(jīng)中活化的巨噬細胞內(nèi)表達逐漸增加。在損傷初期巨噬細胞中NgR表達尚未增加時，巨噬細胞進入損傷神經(jīng)中吞噬殘留髓鞘，隨著新的神經(jīng)髓鞘再生，巨噬細胞上的NgR與髓鞘中的配體之間的相互作用能夠活化RhoA，促使巨噬細胞從雪旺氏細胞基底層流出。因此NgR介導(dǎo)了神經(jīng)修復(fù)過程中巨噬細胞的清除［21-23］。

六、小結(jié)

Nogo-A對神經(jīng)的抑制作用最強，雖然它主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，但在周圍神經(jīng)內(nèi)表達時，它可以強于周圍神經(jīng)內(nèi)其他的促神經(jīng)再生因子而發(fā)揮作用。另外，Nogo-A的作用機制廣泛，不僅可以通過誘導(dǎo)生長錐塌陷，它還可以影響再生神經(jīng)元的分支數(shù)量，降低其功能。同時它還對神經(jīng)內(nèi)的非神經(jīng)細胞有遷移抑制作用。Nogo-B和Nogo-C分布更為廣泛，其作用也更加多元化，在神經(jīng)系統(tǒng)中，它們不僅擁有與Nogo-A同源的Nogo66結(jié)構(gòu)域從而可以發(fā)揮出抑制神經(jīng)再生的作用，還可以參與細胞凋亡過程，存在著可能影響神經(jīng)生長的其他機制。NgR的作用也較為復(fù)雜，目前研究認為，它是Nogo66抑制軸突生長的關(guān)鍵。是Nogo66的唯一受體。但NgR卻存在著多種配體，除Nogo66外還有髓磷脂相關(guān)糖蛋白和少突細胞髓磷脂糖蛋白。它們均可以與NgR結(jié)合發(fā)揮抑制神經(jīng)再生作用。除此之外，NgR也存在于神經(jīng)元之外的其他細胞影響著神經(jīng)修復(fù)的其它環(huán)節(jié)。

七、展望

縱觀Nogo研究的現(xiàn)狀，對于主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Nogo-A來說，抑制軸突生長只是其功能之一，其他的功能正在逐漸被人們所認識。然而Nogo-A抑制軸突生長的研究仍有許多問題亟待解決，如其在神經(jīng)損傷區(qū)域并沒有明顯表達改變，amino-nogo的具體作用機制尚不清楚等。進一步研究Nogo-A在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，對揭示神經(jīng)再生的機制具有重要意義。另外，對于在體內(nèi)廣泛分布的Nogo-B、Nogo-C和NgR分子，探索其在周圍神經(jīng)損傷中發(fā)揮的作用能夠更深刻、更全面的認識神經(jīng)修復(fù)機制，為調(diào)控周圍神經(jīng)再生提供新的思路。