間充質(zhì)干細胞旁分泌作用對外分泌腺腺體損傷后功能恢復(fù)的研究進展

曹璐 綜述 王帥 張霓霓 黃桂林 審校

【提要】 各種物理性、機械性、化學(xué)性和病原微生物性的刺激均可能導(dǎo)致外分泌腺腺體的損傷，從而使其分泌功能下降。外分泌腺腺體損傷后藥物治療的效果有限，器官移植風(fēng)險大且供體不足。而間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）因其強大的增殖能力、多向分化能力及旁分泌/自分泌作用，為修復(fù)各種外分泌腺損傷提供了一種新思路。本文就MSCs的旁分泌作用在外分泌腺組織工程中的應(yīng)用及研究進展進行綜述。

外分泌腺（Exocrine gland）是一類有導(dǎo)管（單細胞腺無導(dǎo)管）的腺體，其分泌物不進入血液，而由導(dǎo)管流出，如肝臟產(chǎn)生膽汁，通過膽總管流到十二指腸。唾液腺、汗腺、皮脂腺、腸腺、肝等均屬于外分泌腺。胰腺是一種比較特殊的腺體，其外分泌部能產(chǎn)生胰液，由胰管流入十二指腸，屬外分泌腺。而內(nèi)分泌部是分布于胰腺中的小島，叫胰島，由A、B、C、D四種細胞組成，如B細胞能產(chǎn)生胰島素，A細胞能產(chǎn)生胰高血糖素，由體內(nèi)的血管運送到全身各處，所以胰島屬于內(nèi)分泌腺。各種物理性、機械性、化學(xué)性和病原微生物性的刺激均可能導(dǎo)致外分泌腺腺體的損傷，從而導(dǎo)致其分泌功能的下降。

1 間充質(zhì)干細胞

間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）可在各種組織中形成異質(zhì)性多能性基質(zhì)細胞群，具有多向分化能力[1]，因此MSCs對組織損傷的修復(fù)作用已被廣泛應(yīng)用于急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、心肌梗死、心肌瘢痕、肺損傷、軟骨和骨骼損傷、皮膚和神經(jīng)組織損傷等研究中[2-6]。MSCs可通過表面分子及功能特征的組合來識別，表達CD13、CD29/ITGB1、CD44、CD73、CD90、CD105 和 CD106/VCAM-1， 通常缺乏造血 表 面蛋白 CD31/PECAM-1、CD34、CD45/LCA 和 CD11b[6]。迄今為止，還沒有一種獨特的MSCs表面標志物被普遍應(yīng)用于鑒定，還需以附加的功能特征來表征，如細胞呈紡錘樣形態(tài)，黏附在塑性表面的能力及造血、成骨、成脂的分化潛能。即使通過高劑量的電離輻射后，MSCs形態(tài)仍保持穩(wěn)定，分化潛能、細胞凋亡水平、黏附和遷移能力均不受明顯影響[7-9]。

2 MSCs旁分泌作用

一般認為，MSCs發(fā)揮作用的機制為轉(zhuǎn)分化、細胞融合、旁分泌效應(yīng)、攜帶mRNA或miRNA和線粒體轉(zhuǎn)移等。既往認為，干細胞主要作為種子細胞經(jīng)移植后在體內(nèi)分化為靶組織細胞，或與靶組織細胞發(fā)生融合從而達到修復(fù)的目的。但近年來的實驗證實，成體干細胞植入缺血組織后并未分化成相應(yīng)的心肌、內(nèi)皮、腎小管上皮等靶組織細胞，而是通過促增殖、抗凋亡、抗炎等效應(yīng)，顯著改善了缺血后組織的功能[10-12]。MSCs被發(fā)現(xiàn)通過分泌細胞因子、生長因子和其他旁分泌因子，在損傷器官中形成具有支撐作用的微環(huán)境，進而支持其他類型細胞在病變組織中再生[6]。

MSCs的旁分泌效應(yīng)，被認為是最全面和持久的作用模式。有研究認為，MSCs條件培養(yǎng)基（MSCs-CM）可刺激內(nèi)皮細胞（ECs）和平滑肌細胞的生長，這種現(xiàn)象可通過MSCs-CM中檢測到高水平的VEGF和bFGF來解釋，但使用抗VEGF和抗bFGF抗體中和只能部分地削弱這種效應(yīng)，表明除VEGF和bFGF外還有其他潛在的有益趨化因子或細胞因子需要確定，如免疫調(diào)節(jié)因子、抗炎抗凋亡及抗氧化因子等[5]。Selmani等[13]發(fā)現(xiàn)，由MSCs分泌的HLA-G5，可使MSCs對 T淋巴細胞和NK細胞具有免疫抑制作用。研究證明，MSCs可抑制樹突細胞（DC）來源的CD14+單核細胞的分化、成熟及功能，從而抑制T淋巴細胞免疫應(yīng)答；還可誘導(dǎo)CD4+CD25高表達，從而調(diào)節(jié)T細胞。除對淋巴細胞的影響外，MSCs的生物活性成分還可促進巨噬細胞從促炎表型M1（經(jīng)典活化的巨噬細胞）轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡装Y表型M2（替代激活的巨噬細胞）[14-15]。為了防止程序性細胞凋亡，MSCs合成和分泌了經(jīng)典的細胞凋亡抑制劑蛋白，如Bcl-2、survivin和Akt。MSCs除直接合成抑制細胞凋亡的蛋白外，還能分泌細胞因子，抑制凋亡途徑或提高存活率（如VEGF可通過上調(diào)Bcl-2或通過抑制p53介導(dǎo)的細胞凋亡而起到抗凋亡的作用）[16]。當氧化反應(yīng)旺盛時，會發(fā)生以下過程：炎癥細胞浸潤、蛋白酶的釋放及ROS等氧化副產(chǎn)物的積累。而MSC衍生的Stanniocalcin（stc1）可減少ROS相關(guān)的細胞凋亡，表明其在抗氧化活性方面的作用[17-18]。

研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞移植治療存在一些安全隱患，如易成瘤、免疫抑制、植入率分化率低、血管栓塞等不良反應(yīng)。另外，要獲得足夠的干細胞數(shù)量需進行傳代培養(yǎng)，但干細胞多次傳代后生物學(xué)特性可能會發(fā)生改變，出現(xiàn)干細胞老化、癌變等不良后果[19-21]。研究證實，MSCs衍生的條件培養(yǎng)基或外泌體在修復(fù)受損組織中具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用[22]。

MSCs-CM是MSCs在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的上清液，含豐富的生長因子、細胞因子、生物活性因子和組織再生劑等[23-24]。MSCs衍生的細胞外囊泡（EV），包括外泌體（Exosome）和微泡（MV），已被證明在MSC細胞療法中的作用，這些囊泡參與細胞間的通訊、細胞信號傳導(dǎo)以及改變細胞或組織的代謝[25-27]，MSC-Exo中的蛋白或RNA能調(diào)節(jié)細胞的增殖分化，并促進細胞歸巢作用，從而促進損傷修復(fù)及組織再生[28-29]。與MSCs移植相比，MSCs-CM及外泌體更方便儲存和運輸，且避免了許多細胞移植的相關(guān)風(fēng)險，更具安全性[29]。Damania等[30]證明，MSCs來源的外泌體對干細胞沒有任何細胞毒性，減少了由于損傷條件而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，同時顯示出更好的細胞保護性及細胞活性。MSC-Exosome在骨損傷、皮膚損傷、神經(jīng)損傷及肝損傷等的修復(fù)上都具有積極的作用[31]。

在局部損傷、炎癥、缺氧等刺激的誘導(dǎo)下，可促進MSCs旁分泌因子的釋放。王丹等[32]證實了輻射預(yù)處理MSCs可以破壞其分化能力，但保留旁分泌能力，當＜4 Gy劑量的60Co γ射線輻射后VEGF及bFGF水平無明顯降低，與未經(jīng)輻射的對照組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而≥4 Gy劑量輻射后 MSCs的Ⅷ因子陽性率顯著降低，說明其分化能力受損。該實驗證明4 Gy劑量的60Co γ射線既不影響 MSCs的旁分泌功能，同時又能抑制其分化能力，為后期研究MSCs的旁分泌實驗細胞模型的建立提供一個新思路。

3 MSCs旁分泌在外分泌腺損傷中的作用

3.1 唾液腺損傷

大約有70%接受頭頸部放療的患者因主要的幾個大唾液腺靠近腫瘤原發(fā)灶和淋巴結(jié)位點經(jīng)常被照射，導(dǎo)致唾液腺功能逐漸喪失，從而直接或間接影響患者的生活質(zhì)量。并發(fā)癥包括味覺喪失、灼口癥、齲齒和其他口腔傳染病，以及吞咽困難、發(fā)音障礙，甚至導(dǎo)致心理疾病。改進放療技術(shù)、放療前轉(zhuǎn)移頜下腺，以及促涎劑的使用等仍無法實現(xiàn)對唾液腺功能長效的改善[33-34]。

頭頸部放療通常會導(dǎo)致唾液腺發(fā)生不可逆性的損傷。Stiubea-Cohen等[35]證實，在輻射后12周，唾液分泌逐漸減少到初始水平的50%，通過蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜（MS）分析后進一步檢測了唾液蛋白質(zhì)組合物，結(jié)果顯示來自下頜下腺（SSG）的蛋白質(zhì)表達減少，而來自血清的蛋白質(zhì)表達增加，兩者均提示唾液腺組織的損傷。為了檢查mRNA表達水平的變化，進行了微陣列分析，發(fā)現(xiàn)95個基因有著顯著變化，包括細胞周期阻滯基因、SG功能基因和DNA修復(fù)基因等。

Shin等[36]將人腮腺上皮細胞與hADMSC進行3D共培養(yǎng)。結(jié)果表明，低氧預(yù)處理hADMSCs保護唾液腺免受輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡，并通過hADMSC旁分泌因子（包括FGF10）的作用激活FGFR-PI3K信號來保持腺泡結(jié)構(gòu)和功能。An等[37]將hADMSC分離、擴增并暴露于低氧條件下（O2＜5%），將缺氧條件培養(yǎng)基過濾至高分子量級，并制備成hADMSC分泌物。實驗證實，條件性hADMSC分泌物含有高水平的GM-CSF、VEGF、IL-6和IGF-1，與對照組相比，用 hAdMSC分泌物重復(fù)輸注，唾液分泌能力增強，同時唾液蛋白（包括淀粉酶和EGF）的水平增加，且SG的顯微結(jié)構(gòu)完整性得以保存，并保護唾液上皮（AQP-5）、內(nèi)皮（CD31）、肌上皮（α-SMA）和 SG祖細胞（c-Kit）免受輻射損傷。同時，實驗還證明缺氧預(yù)處理可促進hADMSC的抗凋亡作用。

3.2 汗腺、皮脂腺損傷

研究認為，MSCs介導(dǎo)的傷口愈合涉及多種機制，包括抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)活動[38]。皮膚及其附屬器（如毛囊、皮脂腺、汗腺）在皮膚的基本功能中發(fā)揮著重要的作用，如熱調(diào)節(jié)、感覺和潤滑等，由于受傷或燒傷可能會導(dǎo)致局部或全層的損傷。在全層皮膚缺損的情況下，汗腺及皮脂腺不可再生，導(dǎo)致分泌功能喪失。皮膚再生是一個動態(tài)且復(fù)雜的過程，需要一系列涉及表皮細胞、皮膚細胞、生長因子、細胞外基質(zhì)（ECM）、受損部位神經(jīng)、血管的協(xié)調(diào)相互作用。Wu等[29]證實，MSC-Exosomes能夠通過傳遞Wnt4及轉(zhuǎn)運Wnt11來激活皮膚細胞中Wnt/β-catenin途徑，以促進皮膚傷口愈合并在損傷后恢復(fù)皮膚完整性。Padeta等[39]利用MSC-CM在背部燒傷大鼠模型中進行局部治療，結(jié)果顯示MSC-CM可促進大鼠皮膚燒傷創(chuàng)面的恢復(fù)。

李倩坤等[40]利用定量紫外線照射人永生化表皮細胞（Ha-CaT）構(gòu)建表皮細胞光老化模型，培養(yǎng)人絨毛膜間充質(zhì)干細胞（CDSCs），將不同濃度的 CDSCs上清液（CDSC-CNM）作用于光老化表皮細胞，結(jié)果顯示CDSC-CNM對光老化表皮細胞有修復(fù)再生作用，可有效增強細胞活力、減少ROS生成量，并減輕DNA損傷程度，有望用于治療大面積汗腺損傷患者。

3.3 胰腺、腸損傷

放射治療在惡性骨盆腫瘤中具有至關(guān)重要的作用，腸對放射線非常敏感，接受放療的腹部惡性腫瘤患者（10%～20%）在治療結(jié)束后數(shù)年發(fā)生腸道并發(fā)癥，輻射產(chǎn)生自由基，通過直接和間接的作用，誘導(dǎo)隱窩細胞的凋亡，導(dǎo)致黏膜損傷并喪失上皮屏障能力。動物模型實驗已證明，靜脈內(nèi)（IV）注射MSC可減少由電離輻射引起的嚴重的結(jié)直腸損傷，IV-MSC治療促進了上皮再生從而使腸組織結(jié)構(gòu)改善，同時限制纖維化過程[41-43]。

劉婉薇等[44]通過炎癥預(yù)激活BMSCs條件培養(yǎng)基對急性輻射損傷小腸上皮進行治療，結(jié)果表明炎癥激活狀態(tài)下的BMSCs條件培養(yǎng)基可促進輻射損傷小腸結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。鄭躍等[45]通過缺氧誘導(dǎo)也得到相同結(jié)論。Pouya等[46]將MSCCM注射小鼠急性結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)小鼠體重減輕癥狀緩解、血便減少、大便黏稠度改善，發(fā)現(xiàn)其上皮細胞損傷、杯狀細胞破壞、彌漫性纖維化、隱窩破壞和炎癥細胞浸潤顯著減輕。劉敏等[47]將MSCs培養(yǎng)上清作用于急性胰腺炎大鼠模型，顯示其胰腺組織病理損傷減輕，IL-6及TNF-a水平明顯減低。

3.4 肝臟損傷

肝臟具有強大的自我修復(fù)和再生能力，該特性使肝臟免受食物毒素引起的毀滅性的肝臟損傷，但發(fā)生急性肝功能衰竭（ALF）時，常導(dǎo)致患者死亡。肝移植是首選治療方法，但存在器官捐獻者短缺、費用昂貴、倫理學(xué)限制、需長期服用免疫抑制劑等問題，這使得干細胞移植成為治療該疾病的新希望[48]。

Xu等[49]的研究表明，MSC-CM可通過抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)miRNA表達，從而減輕H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激肝損傷。此外，miR143的下調(diào)可保護人類肝細胞系L02細胞免于凋亡，并通過調(diào)節(jié)HK2 ADRB1和凋亡相關(guān)蛋白的表達啟動抗凋亡過程。Chen等[50]在MSC-CM修復(fù)輻射性肝損傷的體內(nèi)及體外實驗中，觀察到MSC-CM抑制輻射誘導(dǎo)的SD大鼠肝竇狀內(nèi)皮細胞（Sinusoidal endothelial cell，SEC）凋亡，肝組織切片顯示MSC-CM預(yù)處理組的竇性充血和脂肪變性顯著減少，血清透明質(zhì)酸 （Hyaluronic acid，HA） 顯著下降，TNF-α、IL-1β和IL-6的表達降低而IL-10的表達增加。總之，MSC-CM治療對SEC凋亡和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)具有顯著的抑制作用，最終改善經(jīng)受輻射誘導(dǎo)的大鼠肝損傷。Damania等[30]利用富含外泌體的分級分泌蛋白質(zhì)組修復(fù)肝損傷的體外模型，結(jié)果證實外泌體的抗凋亡/促存活及抗氧化等作用，臨床可用于肝移植病例以減少缺血/再灌注損傷相關(guān)的組織損傷或用于治療急性肝衰竭。

4 展望

MSCs作為一種來源豐富的種子細胞，在外分泌腺的損傷修復(fù)中發(fā)揮著巨大的作用，研究證實旁分泌作用是其主要的修復(fù)機制，未來或許可以利用條件培養(yǎng)基或外泌體等代替細胞對外分泌腺損傷進行修復(fù)，并可進行大批量、標準化生產(chǎn)。隨著組織工程的發(fā)展及研究的深入，間充質(zhì)干細胞的旁分泌作用會在外分泌腺損傷修復(fù)方面占據(jù)更重要的地位。