3D生物打印復層空腔組織的初步研究

皮慶猛 王曉磊 張志亮 周碧玉 任曉蕓 陸毅 黃一雄 傅敏剛 范志宏

硬材料3D打印已經展現了廣泛的研究和應用價值，但是生物打印的研究尚處在早期階段。為實現具有功能的生物活性組織的精確打印，理想的可打印生物材料應具有良好的生物相容性、支架結構具備良好孔隙率，并兼有降解性及快速可塑性[1-3]。由于可打印生物材料的限制，利用生物打印技術，快速構建復雜空腔組織或器官尚面臨巨大挑戰(zhàn)。

目前，較常用的可生物打印材料主要為水凝膠成分，一般是借助交聯的方法實現打印過程中由液相向固相轉變，即凝膠化[4]。甲基丙烯酸酐化明膠（GelMA）是一種明膠衍生物，經化學修飾后，可經UV照射快速交聯形成網狀結構[5]。文獻報道GelMA 5%（m/v）～10%（m/v）交聯后具有良好的細胞相容性，同時具有一定的打印可塑性[6]。海藻酸鹽（Alginate）具有Ca2+快速交聯的特性，但細胞在該種水凝膠里生長緩慢，伸展受限，濃度越高越不利于細胞生長[7]。在生物打印時一般將其濃度控制在1%（m/v）～2%（m/v）。

我們的前期研究證實，利用復合水凝膠可同時打印含有血管內皮細胞和BMSC的單層管狀結構，打印后結構可實現灌注功能，細胞-支架復合物在體外可長期存活，并能在結構內鋪展[8]。本實驗以GelMA和Alginate為打印生物墨水，采用離子交聯（Ca2+）和光交聯快速分步固化的方法，探討3D生物打印具有亞層次結構的復合空腔管狀組織的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豬源明膠（Gelatine，type-A，300 bloom）、甲基丙烯酸酐（Methacrylic Anhydride，MW=154.16 KDa）、海藻酸鹽（Sodium alginate，MW=33 KDa，low viscosity）、氯化鈣、EDTA等購自Sigma公司。胎牛血清、PBS、HEPES緩沖液、0.25%胰酶、高糖基礎培養(yǎng)液DMEM等購自Gibico公司。細胞活力檢測（Live/dead）試劑盒、細胞增殖能力檢測試劑盒（Prestoblue）、細胞骨架蛋白 F-actin（Alexa-594、Alexa-488）、細胞核染料DAPI、Celltracker（綠、紅）、Microbeads（綠、紅）等購自Life Technologies公司。

Instron生物力學檢測儀 （Model5542，美國），RHEOPLUS-32 流變儀（Anton Paar，德國），3D 生物打印機 NovoGen MMX bioprinter（Organovo，美國），多通道打印噴頭由本實驗室自行組裝。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合水凝膠制備

①制備GelMA：豬源明膠10 g，溶于無菌100 mL PBS中攪拌，240 r/min、50℃恒溫溶解1 h；緩慢加入1.25 mL甲基丙烯酸酐，240 r/min、50℃恒溫溶解2 h；加入100 mL PBS稀釋混勻，轉入濾膜攪拌透析5～7 d，40 ℃、500 r/min，每日更換透析液（去離子水）2次；透析結束后，無菌濾網（Millipore）過濾，分裝至50 mL離心管，-80℃冷凍存放2～3 d；依次凍干機凍干5～7 d，室溫存放備用。②基礎工作液：200 mL滅菌水加入10%FBS，緩沖液HEPES調整pH值至7.4。 ③稱取GelMA 7%（w/v）分別與 1%、2%、3%（w/v）的Alginate，兩兩混合溶于基礎工作液，進行分組實驗，即：GA1、GA2、GA3，單純 GelMA 和 Alginate 組為對照組。④輕微震動、加熱搖勻5 min后，放置37℃培養(yǎng)箱備用。

1.2.2 生物力學檢測

①制備PDMS模具：將PDMS液相A/B劑按照10∶1配比，80℃烤箱烘干固化1 h，做成直徑1 cm、高度0.8 mm的圓柱狀孔型模具。75%乙醇浸泡消毒30 min，備用。②無菌3%CaCl2200 μL滴入孔中浸潤覆蓋底部，備用。③將不同配比的復合水凝膠（GA1，GA2，GA3，GelMA 和 Alginate 五組）， 分別滴加入孔中，表面與孔周平面平齊。④表面再次滴加3%CaCl2200 μL，交聯后備用；每組4個樣本。⑤樣本放入UV燈下8 cm處，波長360～480 nm，6.9 mw/cm2交聯30 sec。⑥將樣本逐一放入Instron生物力學檢測臺上，以1 mm/min 60%的力壓縮樣本，采用Bluehill軟件分析記錄壓縮距離compression（mm）和壓力load（N），取曲線0%～10%的形變區(qū)間計算楊氏模量。

1.2.3 打印可塑性檢測

①將不同復合水凝膠分別均分為2份，加入綠色（內層）和紅色（外層）顏料Microbeads，振動混勻，分別移入兩支3 mL注射器，并固定于打印機器NovoGen MMX bioprinter的助推泵上。②將綠色管與紅色管與多通道打印噴頭分別以軟管鏈接，以打印不同層次，以heater維持周圍溫度。③3%CaCl2同樣注射器吸取3 mL后，連接打印噴頭并固定。④通過調節(jié)打印噴頭行進速度及不同通道間的推進流速，以打印出穩(wěn)定的空心管結構。⑤將打印出的空心結構，取橫斷面置于熒光顯微鏡下觀察，以確定具有內、外雙層結構。

1.2.4 復層管腔組織打印

①無菌復合水凝膠G7A2兩份各3 mL，置37℃培養(yǎng)箱備用。②取狀態(tài)良好的小鼠成纖維細胞3T3，分為兩組，分別用綠色、紅色Celltracker標記，并調整細胞數量為2×106個，消化離心后，去上清，保留細胞團塊，備用。③分別用復合水凝膠液重懸細胞團塊，輕輕混勻，移入注射器內，并固定于打印機推進泵上，連接軟管。④以無菌3%CaCl2注射器吸取3 mL后，連接打印噴頭并固定。⑤調整打印噴頭速度及推進速度，以打印出復層結構管狀組織。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每3日換液。⑥分別在第 1、3、7、10、14 和 21 天，取樣本組織塊，以 live/dead試劑盒檢測細胞活力。⑦不同時間點取樣本，將標記后的樣本于倒置熒光顯微鏡下觀察，不同視野隨機取3個區(qū)域，拍照。⑧分析比較各組在不同時間點細胞活力的差異。

1.2.5 打印后復層管腔組織灌注實驗

①含有內外復層3T的管狀打印方法同前。②將打印后復層管狀組織用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)24 h。③用27G針頭，固定打印復層管一端，用含有紅色熒光的灌注液，持續(xù)灌注復層管狀組織。④熒光紫外燈照射下，視頻記錄灌注情況。

2 結果

2.1 復層空腔組織打印策略

理想的可打印生物水凝膠材料是實現復雜組織構建的關鍵因素。據文獻報道，海藻酸鹽可以通過離子鍵（Ca2＋）快速交聯固化，具有良好的快速打印塑型的能力，但是該種水凝膠材料不利于細胞在其內長期生長和鋪展。而明膠衍生物GelMA具有良好的細胞相容性，被化學修飾后加上了光敏的酸酐鍵，經紫外光交聯后可彼此形成共價鍵，從而凝膠固化，但是其力學性能不夠。本實驗結合兩種水凝膠的優(yōu)劣，我們先將復合水凝膠通過離子交聯塑型，再光交聯固化GelMA，從而實現在3D生物打印的過程中快速構建管狀結構的目的（圖1A-B）。

復雜的空腔組織或器官往往具有兩種或以上的亞層次結構，為了實現不同亞層的差異化構建，我們設計了一種同軸多通道生物打印系統(tǒng)（圖1B）。將不同的亞層組織細胞類型，跟相應的細胞外基質混合，利用該系統(tǒng)分別將不同層面同時打印，一次性構建兩種或以上的復層管狀結構（圖1C）。

2.2 復合水凝膠力學性能

為了實現打印過程中快速交聯固化，我們采用本實驗室制備的GelMA[9]，打印過程中我們選擇GelMA的濃度為7%[8]。為了增加空腔管腔結構的力學強度，我們根據文獻報道，將不同濃度（1%、2%、3%）的Alginate分別與7%GelMA混合，力學測試結果顯示，復合水凝膠楊氏模量為（8.78±1.73）×10-3MPa，較單純 GelMA 的楊氏模量（2.38±0.69）×10-3MPa和單純海藻酸鹽的楊氏模量（0.83±0.24）×10-3MPa，有明顯統(tǒng)計學差異（圖2A）。復合水凝膠的力學強度明顯高于單純對照組，隨著海藻酸鹽濃度從1%增加到3%，復合水凝膠的力學強度也相應增加（圖2B）。這提示兩次交聯后，組織硬度明顯增加。但是，組織結構過硬，不利于細胞在結構內鋪展生長。因此我們將海藻酸鹽的濃度控制在3%以下，在保證可打印的前提下盡量降低海藻酸鹽的濃度。

2.3 打印可塑性

新型設計的同軸多通道生物打印系統(tǒng)，利用不同的通道分開，同步打印不同的管狀結構的亞層，通過顏色區(qū)分標記。我們發(fā)現，打印后的復層管狀結構，不同層次間具有明顯區(qū)分（圖3A-C）。內、外層結構內的顏色標記，經兩次交聯后并沒有相互滲入或混合，這說明兩層結構是完全獨立的，理論上可以實現解剖剝離。

通過顯微鏡下定量測量，內、外層管壁的厚度為（62.06±0.45） μm 和（93.78±10.25） μm，提示每層結構可具有人體1～2個細胞的厚度。內、外管的管徑分別為（663.66±51.74） μm 和（976.84±63.44） μm，與人體內微動脈、尿道或輸尿管等內徑相當，說明通過多通道共軸打印系統(tǒng)可獨立同步構建復層管狀結構。

2.4 復層管腔組織打印

為明確細胞對于復合水凝膠的相容性，將同等數量的小鼠成纖維3T3細胞，與含有不同濃度海藻酸鹽的復合水凝膠及單純GelMA和海藻酸鹽混勻，利用同軸多通道系統(tǒng)生物打印，依次快速離子交聯和光交聯。第 1、3、7 天細胞活力分別為（88.50%±5.8%）、（85.57%±6.22%）和（96.29%±2.64%）（圖 4A-E）。我們觀察到，細胞經過長時間的打印過程，打印通道會對細胞造成一定損害，打印第3天的細胞活力比打印即刻或第一天的活力有所降低，而對于這一現象，有文獻解釋為打印后細胞部分失活壞死造成，這與我們觀察到的結果基本一致。

為了便于觀察不同層次間細胞是否會相互滲透，我們打印前將內、外層細胞分別用綠色和紅色的細胞示蹤劑予以標記。打印后4天d，我們發(fā)現綠色熒光信號只分布在內層，而紅色熒光信號只分布在外層（圖4F-G）。這說明該同軸多通道生物打印系統(tǒng)可同時打印出復層空腔管狀結構的不同組織層次，而不同層次的細胞間可在短期內滯留在相應的組織層次內。

2.5 打印復層管腔結構的灌注功能

圖1 復層管狀結構水凝膠打印策略模式圖Fig.1 Design of hydrogel 3D bioprinted hollow structure with multiple layers

為了檢測管狀組織是否具有灌注功能，我們于打印第一天，將含有3T3細胞的復層管狀組織，鏈接27G注射器針頭，持續(xù)灌注含有顏料的溶液，不同時間點在熒光下拍照、錄像。實驗發(fā)現，復層管狀組織內，有色顏料溶液并沒有滲出到管壁外側，這說明含有雙層細胞的管狀結構的組織管壁完整性良好，能夠實現灌注功能（圖5）。

圖2 復合水凝膠力學檢測Fig.2 Mechanical test of blend hydrogels

圖3 復層管狀結構打印Fig.3 Printing of double-layer structure

圖4 復層管狀組織打印Fig.4 Bioprinting of hollow tissue with double-layer loading with cells

圖5 復層管狀組織灌注實驗（Bar=1 cm）Fig.5 Perfusion test of printed tissue with microbeads(Bar=1 cm)

3 討論

3D打印在醫(yī)學領域已經展現了廣泛的應用價值，如3D打印的人工關節(jié)、耳蝸、復雜骨缺損替代物等。但是，3D生物打印尚處在早期研究階段[10]。目前，3D生物打印構建單一實體組織的研究已有報道，如心肌、軟骨、皮膚等[11]。但是，對于空腔管狀組織的生物打印，特別是打印復雜的、具有不同亞層次結構的空腔管狀組織或器官尚無成功的報道。

理想的水凝膠是構建復雜空腔組織的關鍵因素。本實驗利用海藻酸鹽可被Ca2＋快速交聯和GelMA被光照射快速交聯的特性，初步探討了構建復層空腔組織的可行性。本實驗在生物打印過程中，首先利用CaCl2快速固化復合水凝膠中的海藻酸鹽以初步塑型水凝膠，形成空腔結構，而后利用UV照射交聯GelMA，EDTA洗掉海藻酸鹽后留下GelMA作為細胞支架材料復合物。通過兩次快速交聯固化水凝膠，可增加一定的力學強度，以達到生物打印后快速構建復雜管腔結構的目的。實驗中，我們證實復合水凝膠可以同時同步一次性打印出具有不同層次的復層管狀結構，而兩層亞結構內水凝膠或細胞均固化良好，短期內不會相互滲透。

細胞與材料具有良好的生物相容性，是構建具有生物功能的組織或器官的另一關鍵因素。增加海藻酸鹽的濃度，將更有利于打印的快速塑形，但是高濃度的海藻酸鹽不利于細胞生長。實驗中，我們將海藻酸鹽的濃度控制在3%以下，而GelMA控制在5%以上，細胞的活力在打印后可維持在85%以上。但是，由于打印過程對細胞的剪切、擠壓等因素，使得打印后細胞活力在第2～3天有明顯的降低，該現象與文獻報道基本一致[12]。而短期內含有細胞的復層管狀結構具有良好的灌注功能，注射的含有顏色的溶液，可以快速通過管腔結構，但沒有滲出到管壁外側。然而，實驗發(fā)現，長期培養(yǎng)（2周以上）時打印的組織形態(tài)難以維持，力學強度非常差，理想的打印材料還需要進一步探索。

綜上所述，本實驗初步證實，利用GelMA和海藻酸鹽復合的水凝膠可快速打印具有復層結構的空腔管狀結構，所打印細胞具有良好的活性。該結果為構建復雜空腔組織或器官提供了借鑒，但仍有待于進一步的探索。