E3泛素連接酶對糖尿病冠狀動脈大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的調(diào)控及機制探討?

錢玲玲 劉曉宇 王如興

目前，糖尿病對冠狀動脈功能的影響及機制尚不完全清楚，可能與冠狀動脈平滑肌細(xì)胞上大電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道(large conductance calcium activated potassium channel，BK通道)異常有關(guān)[1－2]。糖尿病時BK通道表達(dá)降低與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)對其泛素化降解增加有關(guān)，而這一過程受UPS中特異性的E3泛素連接酶調(diào)控。筆者在介紹UPS和糖尿病冠狀動脈BK通道改變的基礎(chǔ)上，重點闡述E3泛素連接酶對糖尿病冠狀動脈BK通道的調(diào)控及其機制，以期為尋找糖尿病患者心血管疾病治療的新靶點提供思路。

1 UPS

UPS是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平與功能[3]。UPS包括泛素、泛素酶、蛋白酶體及其底物蛋白等，其中泛素酶分為3大類:泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3[4]。E1起活化泛素的作用，E2與活化的泛素結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運到需要降解的底物蛋白質(zhì)分子上，E3需要用其特異性的氨基酸序列和磷酸化結(jié)構(gòu)域來識別靶蛋白，確保E2將泛素轉(zhuǎn)運至底物蛋白結(jié)合，這樣形成靶蛋白多聚泛素鏈，即泛素化。而后蛋白酶體系統(tǒng)可識別已泛素化的蛋白并將其降解[4]。至今發(fā)現(xiàn)的E1僅有唯一1種，E2有大于25種，E3有1 000多種。不同的底物蛋白泛素化過程依賴于特異性的E3，所以不同的泛素連接酶E3在不同疾病中的調(diào)控作用是研究的熱點。

2 E3泛素連接酶對糖尿病冠狀動脈BK通道的調(diào)控及其機制

BK通道是冠狀動脈平滑肌細(xì)胞上存在的最主要的鉀離子通道之一，對冠狀動脈血管舒縮功能起重要的調(diào)控作用[5－9]。糖尿病時，BK通道不僅開放概率減少[10－11]，電壓依賴性及鈣離子依賴性受損[11－12]，且其電流密度及β1亞基蛋白表達(dá)顯著降低[13－14]，導(dǎo)致糖尿病冠狀動脈血管收縮增強，舒張減弱。近年來研究表明，糖尿病冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BK-β1亞基表達(dá)下降與泛素化調(diào)控密切相關(guān)。目前，已有文獻(xiàn)報道與BK通道泛素化相關(guān)的E3連接酶包括F-box蛋白(FBXO)[15]、WNK4(with-no-lysinekinase-4)[16]、肌肉特異性環(huán)指蛋白1(MuRF1)[2]以及CRL4A(CRBN)[17]等。其中，WNK4可影響B(tài)K-α亞基的降解，過表達(dá) WNK4可抑制BK-α亞基表達(dá)[16]。CRL4A(CRBN)失活可從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放去泛素化的BK通道至細(xì)胞膜，導(dǎo)致BK通道活性增強[17]。目前研究較多的是糖尿病時FBXO和MuRF1對冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BK通道的調(diào)控作用及其機制[2，15]。

2.1 FBXO蛋白對冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BK通道的調(diào)控及機制 FBXO是SCF(Skp1-Cullin-F-box)泛素連接酶復(fù)合體的重要組成部分，通常作為酶-底物的相互作用位點[18]。FBXO蛋白表達(dá)由F-box O家族轉(zhuǎn)錄因子FOXO調(diào)控，而FOXO的活性受蛋白激酶B(Akt)的負(fù)性調(diào)節(jié)。Akt可使FOXO磷酸化，磷酸化后的FOXO出細(xì)胞核，并喪失轉(zhuǎn)錄功能[19]。FBXO-9與FBXO-32是肌細(xì)胞中特異表達(dá)的FBXO亞型，在心肌細(xì)胞與骨骼肌細(xì)胞中大量表達(dá)[20－21]，其中FBXO-32可與底物蛋白的PDZ結(jié)合基序結(jié)合[20]，而BK-β1亞基上就存在這樣的PDZ結(jié)合基序[15]。

在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠冠狀動脈以及高糖培養(yǎng)的人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞中，BK通道電流密度降低，開放概率減少，BK-β1亞基蛋白表達(dá)下降，而BK-β1亞基蛋白泛素化水平明顯增加，與此同時伴隨FBXO-9與FBXO-32的蛋白表達(dá)明顯增加[15]。采用小干擾RNA技術(shù)下調(diào)冠狀動脈平滑肌細(xì)胞中FBXO-9的表達(dá)，可使BK-β1亞基蛋白表達(dá)增加1.65倍[15]。在FBXO的激動劑阿霉素孵育的細(xì)胞上，BK-β1亞基蛋白表達(dá)明顯下降；在BK-β1亞基特異性的激動劑DHS-1作用后BK通道開放并不增加。而采用蛋白酶抑制劑MG-132同時處理可阻滯阿霉素引起的BK-β1亞基蛋白表達(dá)下降效應(yīng)，表明FBXO確實參與調(diào)控BK-β1亞基蛋白表達(dá)[15]。轉(zhuǎn)染人BK-β1亞基基因的 HEK293細(xì)胞，在FBXO和泛素共同處理后，BK-β1亞基泛素化水平明顯增加；但轉(zhuǎn)染PDZ結(jié)合基序突變的人BK-β1組，則BK-β1亞基泛素化水平變化不明顯，證實BK-β1亞基中PDZ結(jié)合基序突變可阻止BK-β1亞基泛素化和蛋白降解[15]。糖尿病時FBXO的表達(dá)增加可能受FOXO-3a的磷酸化水平降低的影響，正常細(xì)胞在Akt抑制劑LY294002處理后，Akt和FOXO-3a的磷酸化水平減弱，而FBXO-32表達(dá)增加，BK-β1亞基蛋白減少，進(jìn)一步證實FBXO途徑對BK通道的調(diào)控可能與Akt磷酸化水平相關(guān)[15]。

在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血管組織以及高糖培養(yǎng)的人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞中，BK-β1亞基蛋白減少，并伴隨FBXO-32蛋白表達(dá)增加，F(xiàn)OXO-3a磷酸化水平降低，以及Akt磷酸化水平下降[22]。人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞予Akt抑制劑LY294002處理后，Akt磷酸化水平降低，F(xiàn)OXO-3a的磷酸化水平下降，F(xiàn)BXO-32蛋白表達(dá)增加，BK-β1亞基蛋白減少，這與高糖培養(yǎng)產(chǎn)生的效應(yīng)一致[22]。糖尿病時FBXO的上調(diào)還可能與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，糖尿病可引起血管組織中蛋白激酶Cβ和氮氧化物表達(dá)增加，氧化應(yīng)激水平升高[23]。過氧化氫刺激后冠狀動脈平滑肌細(xì)胞FBXO-32蛋白表達(dá)增加，BK-β1亞基蛋白表達(dá)減少，證實糖尿病時氧化應(yīng)激通過上調(diào)FBXO而引起B(yǎng)K-β1亞基蛋白表達(dá)減少[22]。高糖培養(yǎng)的細(xì)胞予蛋白激酶C抑制劑ruboxistaurin或過氧化物酶體增殖活化受體激動劑GW501516處理，可逆轉(zhuǎn)高糖引起的Akt/FOXO-3a/FBXO-32信號通路效應(yīng)，BK-β1亞基蛋白表達(dá)增加[22]。糖尿病小鼠予以ruboxistaurin或GW501516后與細(xì)胞實驗結(jié)果一致，BK-β1亞基蛋白表達(dá)增加，BK通道功能增強，并且改善了受損的糖尿病小鼠血管舒張功能。

2.2 MuRF1蛋白對冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BK通道的調(diào)控及機制 肌肉特異性環(huán)指蛋白家族有3個成員，包括MuRF1、Mu RF2和MuRF3，是一組肌肉特異性的E3連接酶。這三種亞型均在心肌和骨骼肌組織中豐富表達(dá)，且都包含4種重要的結(jié)構(gòu)域:一個環(huán)指結(jié)構(gòu)域，一個MuRF家族的保守區(qū)域，一個“B-box”域和多個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域[24]。Mu RF1已被證實參與調(diào)控多種心血管疾病，包括心肌肥厚、心肌缺血和心肌炎等[25]，近年來發(fā)現(xiàn)肌肉特異性環(huán)指蛋白參與血管功能調(diào)控[2]。

在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血管組織中，BK通道開放減少，泛素化水平增加，BK-β1亞基蛋白表達(dá)下降，同時發(fā)現(xiàn)MuRF1蛋白水平增加[2]。采用小干擾RNA技術(shù)下調(diào)Mu RF1表達(dá)時，BK-β1亞基蛋白表達(dá)增加；而采用腺病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)MuRF1時，BK-β1亞基蛋白表達(dá)降低。腺病毒轉(zhuǎn)染MuRF1的冠狀動脈對BK通道激活劑NS1619濃度依賴性舒張減弱，孵育蛋白酶體抑制劑MG132可使單純過表達(dá)Mu RF1產(chǎn)生的效應(yīng)恢復(fù)，證實 Mu RF1可通過泛素化調(diào)控BK-β1亞基表達(dá)[2]。后續(xù)實驗研究也證實了BK-β1亞基的N末端可與Mu RF1的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域相互作用。

糖尿病時 MuRF1的表達(dá)升高受核因子-κB和核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)激活的調(diào)控。Nrf2信號在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡發(fā)揮重要作用。在腎、心肌和血管平滑肌等細(xì)胞中，激活Nrf2可對抗高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，起到細(xì)胞保護(hù)作用[26]。在db/db糖尿病小鼠動脈組織內(nèi)，BK-β1亞基蛋白表達(dá)下降，MuRF1蛋白水平增加，并且伴隨Nrf2的表達(dá)減少，這與在人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞中下調(diào)Nrf2產(chǎn)生的效應(yīng)一致；而腺病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)Nrf2可使Mu RF1蛋白水平下降，BK-β1亞基蛋白表達(dá)增加[27]。這些結(jié)果證實糖尿病時Nrf2的減少可導(dǎo)致Mu RF1蛋白增加，從而BK-β1亞基降解增加。糖尿病小鼠予以Nrf2的激動劑富馬酸二甲酯給藥，可升高BK-β1亞基蛋白表達(dá)，并改善血管功能。在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖型糖尿病小鼠模型中也得到同樣的結(jié)果[28]，并且 Nrf2可能是核因子-κB(NF-κB)的上游信號，腺病毒轉(zhuǎn)染 Nrf2后，NF-κB/p50和 NF-κB/p65均表達(dá)降低。在體使用Nrf2的激動劑富馬酸二甲酯可減少肥胖型糖尿病小鼠的體重和血糖值，促進(jìn)BK-β1亞基的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，減少受 MuRF1調(diào)控的BK-β1蛋白降解，從而對糖尿病冠狀動脈舒張功能起保護(hù)作用。

3 結(jié)語

綜上所述，糖尿病時冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BK通道功能受損，BK-β1亞基蛋白表達(dá)減少，其原因可能與BK-β1亞基蛋白泛素化降解增加有關(guān)。FBXO和Mu RF1是目前已經(jīng)證實的參與BK-β1亞基蛋白泛素化的兩種肌肉特異性的E3連接酶。糖尿病時血管組織中氧化應(yīng)激水平增加，Akt的磷酸化水平減降低，引起FOXO-3a的磷酸化水平降低，F(xiàn)BXO-32的蛋白表達(dá)增加，BK-β1亞基蛋白泛素化降解增加；同時也存在Nrf2表達(dá)減少，導(dǎo)致NF-κB激活降低，引起MuRF1蛋白水平增加，BK-β1亞基蛋白泛素化降解增加，表達(dá)減少，血管功能受損。干擾這些通路中的某些分子，如激活A(yù)kt或Nrf2，抑制BK通道泛素化，對糖尿病冠狀動脈具有保護(hù)作用。因此，深入探討糖尿病時冠狀動脈平滑肌細(xì)胞BK通道泛素化降解機制，可能為尋找糖尿病心血管疾病臨床治療的新靶點提供思路。