蛋白基因產(chǎn)物9.5 (PGP 9.5)在椎間盤源性腰痛的應用研究進展

張 靜 賈家猛 何江濤

（川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院脊柱外科，南充637000）

椎間盤源性腰痛 (discogenic back pain) 是指椎間盤退變、纖維環(huán)內(nèi)破裂、椎間盤內(nèi)炎癥等刺激椎間盤內(nèi)疼痛感受器引起的腰痛，而無根性癥狀，無神經(jīng)根受壓或椎體過度移位[1]。一般認為成人健康的椎間盤是人體最大的無神經(jīng)支配的組織。目前研究表明椎間盤中央部分沒有神經(jīng)末梢存在，僅在和毛細血管相鄰的纖維環(huán)外層區(qū)域有很少的免疫組化可以檢測到的神經(jīng)纖維。但在椎間盤退變過程中有感知疼痛的神經(jīng)纖維和血管向內(nèi)生長進入椎間盤纖維環(huán)內(nèi)層區(qū)域，這種神經(jīng)內(nèi)生長的機制目前尚不完全清楚，這可能是椎間盤源性腰痛發(fā)病機制潛在因素之一。蛋白基因產(chǎn)物9.5 (protein gene product 9.5,PGP 9.5)，是一種神經(jīng)纖維中的特異性泛素羥基水解酶, 1983年 Doran等[2]通過高分辨率雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法從人腦組織中分離出蛋白基因產(chǎn)物9.5, 因其等電點為9. 5而得名 。它是一種分子量為27 kDa的蛋白質(zhì), 由 212個氨基酸組成的胞漿蛋白。PGP 9.5存在所有傳入和傳出神經(jīng)纖維中，是一個非常好的泛神經(jīng)標記物，對神經(jīng)纖維特異性強，作為一種神經(jīng)軸突標記物, 抗PGP 9.5抗體可以與任何無髓或有髓的神經(jīng)纖維相結(jié)合，使用免疫熒光或免疫組織化學的方法即可標記出組織中PGP 9.5陽性的神經(jīng)纖維。

一、PGP 9.5作為神經(jīng)纖維標記物的應用

Wilson等[3]在使用兔多克隆抗體和小鼠單克隆抗體定位PGP 9.5時發(fā)現(xiàn)具有免疫活性的PGP 9.5在各級中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)纖維中都有表達，且用多克隆抗體的標準免疫組化技術(shù)可以清晰的顯示直徑大小不同的神經(jīng)纖維。McArthur等[4]利用抗蛋白基因產(chǎn)物9.5檢測小無髓鞘神經(jīng)纖維來定量人類表皮神經(jīng)纖維密度同樣取得滿意的效果。周重建等[5]采用免疫組織化學方法和激光共聚焦 (Confocal laser scaning microscopy) 技術(shù), 使用多克隆蛋白基因產(chǎn)物9.5 (PGP 9.5)作為神經(jīng)原標記物,觀察大鼠腰5神經(jīng)根受壓后不同時期比目魚肌中運動終板區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)末梢再生狀況。在該實驗中，PGP 9.5免疫組織化學標記結(jié)合激光共聚焦在正常與再生的神經(jīng)肌肉接合部，能清晰地顯示精致的神經(jīng)末梢，因此，PGP 9.5抗體可作為各種不同情況下肌肉神經(jīng)支配、神經(jīng)再支配和神經(jīng)再生的重要研究工具。劉永丹等[6]在對正常人表皮神經(jīng)形態(tài)計量學研究中，以PGP 9.5為特異性軸突標記物進行免疫組織化學染色，發(fā)現(xiàn)皮膚神經(jīng)以及觸覺小體對抗PGP 9.5免疫反應性好，且可以觀察表皮內(nèi)神經(jīng)纖維(Epidermal, IENFs)的走形甚至分支。Fields等[7]在研究腰椎終板與椎間盤的神經(jīng)分布時也用PGP 9.5作為神經(jīng)纖維標記物。相比降鈣素基因相關(guān)蛋白和神經(jīng)絲200，PGP 9.5提供了高特異性，而不混淆的背景染色。但王一兵等[8]在比較蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP 9.5)與神經(jīng)絲蛋白 (Neuro fi lament protein, NFP)對瘢痕組織內(nèi)神經(jīng)纖維的染色效果中卻發(fā)現(xiàn) PGP 9.5標記人瘢痕神經(jīng)纖維的效果不如NFP。

Habash等[9]研究也認為PGP 9.5是中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)最好的免疫組織學標志物，且可清楚地顯示在使用兔多克隆抗體常規(guī)處理的組織。PGP 9.5標記神經(jīng)纖維比神經(jīng)原纖維蛋白更加敏感，尤其是神經(jīng)纖維的末端區(qū)域。PGP 9.5的發(fā)現(xiàn)及應用，結(jié)合抗PGP 9.5進行免疫組化技術(shù)的開展，為研究中樞和周圍神經(jīng)損傷及損傷后神經(jīng)纖維的再生和重塑提供了極大幫助。

二、PGP 9.5在椎間盤源性腰痛研究中的應用

正常椎間盤組織中央部分是沒有神經(jīng)末梢存在的，僅僅在和毛細血管相鄰的纖維環(huán)外層區(qū)域有很少的免疫組化可以檢測到的神經(jīng)纖維，但在椎間盤退變過程中有向內(nèi)生長的感知疼痛的神經(jīng)纖維和血管進入椎間盤的近端的區(qū)域，這可能是導致疼痛的原因[10],即神經(jīng)內(nèi)生長可能是椎間盤源性腰痛潛在的病理神經(jīng)解剖基礎(chǔ)。

1.退變椎間盤中神經(jīng)纖維的重塑

Migagi等[11]在椎間盤退變致腰痛的小鼠模型中，利用免疫組化定位神經(jīng)纖維標記物PGP 9.5和降鈣素基因相關(guān)肽 (Calcitonin gene related peptide,CGRP) 來確認椎間盤退變的神經(jīng)分布，發(fā)現(xiàn)在退變的椎間盤周圍感覺神經(jīng)分布增加。同時用行為實驗證實在椎間盤退變的小鼠模型中，小鼠表現(xiàn)對冷覺、軸向不適，及月齡依賴性的運動障礙增加，推斷退變椎間盤周圍感覺神經(jīng)分布增加與上述小鼠行為改變有關(guān)。任東風等[12]對26例椎間盤源性腰痛病人，疼痛源性椎間盤MRIT2像均可見高信號區(qū)(High signal area, HIZ區(qū)) 行手術(shù)治療，將切除的椎間盤組織行PGP 9.5染色觀察，并與4例脊柱側(cè)凸病人矯形手術(shù)時取出的椎間盤組織對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn):椎間盤源性腰痛病人HIZ區(qū)對應的部位在免疫染色均可觀察到PGP 9.5免疫陽性細胞，對照組沒有觀察到陽性細胞。何江濤等[13]在觀察TNF-a (腫瘤壞死因子α)，PGP 9.5在椎體后緣離斷癥軟骨終板中的表達與分布的研究中，對照組為因腰椎骨折行腰椎融合術(shù)的年輕病人的軟骨終板，對其進行PGP 9.5免疫染色后，均未檢測到PGP 9.5陽性染色，說明在正常狀態(tài)下，軟骨終板組織內(nèi)無PGP 9.5陽性反應神經(jīng)軸突長入。正常椎間盤僅僅纖維環(huán)的外層分布感覺神經(jīng)纖維，而慢性腰痛病人退變的椎間盤纖維環(huán)內(nèi)層有神經(jīng)纖維的出現(xiàn)。退變椎間盤中神經(jīng)纖維的重塑、內(nèi)生長可能是椎間盤源性腰痛的致病機制。

2.椎間盤神經(jīng)內(nèi)生長的機制

神經(jīng)纖維是如何長入纖維環(huán)內(nèi)層無神經(jīng)分布區(qū)還未得到一致的答案，有“經(jīng)終板長入”和“經(jīng)破裂纖維環(huán)長入”兩種學說[14]。

（1）神經(jīng)纖維經(jīng)終板長入

正常椎體的神經(jīng)分布：一部分是伴隨椎體邊緣的血管進入椎體，另一部分是竇椎神經(jīng)的分支經(jīng)由椎間孔進入椎體（終板內(nèi)并無神經(jīng)纖維分布，提示終板也是椎間盤源性疼痛的一個重要來源[15]）。Bailey等[16]用PGP 9.5染色神經(jīng)纖維來定量分析人類腰4椎體神經(jīng)分布的空間模型，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)神經(jīng)都是臨近血管壁走形，椎體內(nèi)神經(jīng)分布的空間模型與其血管分布的空間模型類似。終板與椎體融合生長，但正常情況下椎體周圍血管神經(jīng)并未向終板內(nèi)生長。在腰痛病人，Weisskopf等[17]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維與伴隨的微血管通過椎間盤終板組織長入了椎間盤內(nèi)正常情況下的無神經(jīng)血管區(qū)，且在椎間盤造影術(shù)中疼痛的嚴重程度與相應運動節(jié)段變性終板內(nèi)的血管化程度有一定的相關(guān)性。Ohtori等[18]在炎性因子和椎體終板神經(jīng)長入與椎間盤源性腰痛相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)TNF-α在異常終板的表達升高，并誘導PGP 9.5陽性神經(jīng)軸突向終板長入而最終引起腰痛。Ghilardi等[19]也發(fā)現(xiàn)炎性刺激的存在（即通過從退化的椎間盤釋放炎癥介質(zhì)）刺激毛細血管和神經(jīng)纖維生長到炎癥區(qū)域。

（2）神經(jīng)纖維經(jīng)破裂纖維環(huán)長入

Fagan等[20]在人造綿羊椎間盤纖維環(huán)撕裂的模型中，應用PGP 9.5、酪氨酸羥化酶及降鈣素基因受體蛋白對撕裂的纖維環(huán)進行免疫染色，分別在1、2、3、12月不同時期上述模型中纖維環(huán)撕裂的外圍觀察到神經(jīng)分布，且向內(nèi)生長的神經(jīng)纖維染色略深于正常纖維環(huán)，同樣在纖維環(huán)內(nèi)層及髓核中未觀察到神經(jīng)纖維的分布，說明經(jīng)破裂纖維環(huán)神經(jīng)長入不明顯，但并不能否認破裂纖維在椎間盤源性腰痛中的影響。Aoki等[21]在研究椎間盤退變的兔纖維環(huán)穿刺模型時，發(fā)現(xiàn)在纖維環(huán)穿刺部位的針道中并未有神經(jīng)纖維的長入，而在穿刺點表面形成的瘢痕組織中觀察到PGP 9.5免疫反應的神經(jīng)纖維，推斷纖維環(huán)破壞形成的瘢痕組織為神經(jīng)纖維長入提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。任東風等[22]采用針刺損傷山羊腰椎間盤后部內(nèi)層纖維環(huán)，建立山羊腰椎間盤退變的模型，觀察椎間盤的組織學變化和PGP 9.5陽性神經(jīng)纖維分布，發(fā)現(xiàn)損傷椎間盤3、6個月時內(nèi)層纖維環(huán)存在PGP 9.5陽性神經(jīng)，且神經(jīng)是沿著穿刺道及周圍生長，而未損傷椎間盤中未檢測到PGP 9.5免疫陽性細胞，說明椎間盤損傷后可能誘導了神經(jīng)內(nèi)生長。該實驗只觀察到損傷纖維環(huán)內(nèi)有神經(jīng)長入，所有髓核組織未檢測到PGP 9.5免疫陽性細胞, 但不能排除神經(jīng)纖維是否會長入髓核組織, 需進一步觀察。Freemont等[23]通過椎間盤造影術(shù)研究證實疼痛椎間盤內(nèi)有神經(jīng)末梢的長入。Melrose等[24]在羊椎間盤纖維環(huán)損傷的模型中觀察到在椎間盤纖維環(huán)損傷后有神經(jīng)血管向內(nèi)生長的現(xiàn)象，且與其組織內(nèi)蛋白多糖降解有相關(guān)性。Johnson等[25]研究也發(fā)現(xiàn)椎間盤纖維環(huán)內(nèi)側(cè)及髓核組織內(nèi)的蛋白多糖可以抑制神經(jīng)軸突的長入，而當纖維環(huán)破壞，蛋白多糖降解，對神經(jīng)的抑制作用降低，導致神經(jīng)向內(nèi)生長，因此推斷在損傷的纖維環(huán)中蛋白多糖降解增多解除對神經(jīng)生長的抑制，從而誘導了血管和神經(jīng)的長入。Liang等[26]提出了一個新的假設(shè)，即低pH是腰痛的發(fā)生和發(fā)展的一個可能的原因。低pH促進產(chǎn)生炎癥介質(zhì)同時加速了蛋白多糖在受損椎間盤的耗盡。Shirai等[27]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)向內(nèi)生長并不是單純的神經(jīng)纖維再分布，而是伴隨血管重塑的組織修復。即PGP 9.5增多代表神經(jīng)修復性過程。Zevallos等[28]的研究發(fā)現(xiàn)在女性子宮內(nèi)膜異位癥病人中檢測到分泌蛋白基因產(chǎn)物9.5的基因上調(diào)。并在增殖期引起疼痛。但在椎間盤退變中，還沒有相關(guān)的基因研究。

三、結(jié)論與展望

PGP 9.5作為一種神經(jīng)軸突標記物，對神經(jīng)纖維特異性強。與傳統(tǒng)染色方法相比，其特異性高，染色清晰，操作簡單。在椎間盤源性腰痛的研究中，為神經(jīng)纖維分布、精確定位提供依據(jù)。在診斷方面，傳統(tǒng)的椎間盤源性腰痛診斷主要依靠椎間盤造影并誘發(fā)疼痛。PGP 9.5的應用為腰痛、椎間盤源性腰痛診斷及鑒別診斷提供新的思路。在治療方面，有學者嘗試在間盤內(nèi)通過熱能破壞髓核結(jié)構(gòu),清除纖維環(huán)內(nèi)神經(jīng)末梢，但激光溫度難以調(diào)控,且常損傷周圍組織導致炎癥，技術(shù)要求高[29]。目前學者將能滅活神經(jīng)末梢的亞甲藍用于椎間盤源性腰痛的治療[30,31]，在動物試驗中也觀察到，亞甲藍毀損了長入椎間盤內(nèi)的神經(jīng)纖維，從而緩解椎間盤源性腰痛的癥狀[32]，但目前臨床應用較少。PGP 9.5的應用為精準靶向治療提供依據(jù)及治途徑，也是檢測治療效果的指標。PGP 9.5只能證實在退變椎間盤中確有神經(jīng)纖維長入原本無神經(jīng)分布的區(qū)域，并可能引起疼痛，但神經(jīng)向內(nèi)生長的潛在機制目前尚不完全清楚，將是今后一個研究重點。

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