環(huán)狀RNA與自身免疫性疾病

羅 璇，彭 鈺，鄧垂文，杜志榮，費允云

環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的、穩(wěn)定的競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)。circRNAs的研究始于1976年Sanger等[1]在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)閉合環(huán)狀的RNA結(jié)構(gòu)，1986年Kos等[2]在肝炎病毒中也發(fā)現(xiàn)了同樣結(jié)構(gòu)的RNA，1991年Nigro等[3]提出了人類細胞中可能也存在著circRNAs，但是人們一直認為circRNAs的產(chǎn)生是由于基因的錯誤剪切。隨著RNA-Seq技術(shù)和生物信息學的發(fā)展對大規(guī)模轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)circRNAs大量存在于各類細胞中，且circRNAs的形成有一套完整的調(diào)控機制，是一類缺少5’端帽和3’poly(A)尾、以共價鍵連接首尾而形成的有穩(wěn)定環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA，其結(jié)構(gòu)高度保守且具有表達特異性，具有吸附微小RNA(microRNA,miRNA)、調(diào)控基因表達、翻譯蛋白質(zhì)等的能力[4-5]，參與生物多種細胞的生物學過程。目前的研究認為，circRNAs可參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，并有可能成為疾病診斷或預后判斷的標志物。本文對circRNAs的形成機制、生物學功能及其與疾病，特別是自身免疫性疾病(autoimmune disease，AD)的關(guān)系進行綜述，為AD的病因、診斷及治療提供新的研究方向。

1 circRNAs的形成機制

已有研究報道，真核細胞中circRNAs來源于前體mRNA的反向剪接[4]，但其產(chǎn)生的機制尚未完全闡明。Jeck等[6]提出了circRNAs生成模型，即套索驅(qū)動的環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化，前者是由一個外顯子的3’剪接供體與另外一個外顯子的5’剪接受體共價結(jié)合，通過外顯子的跳躍形成套索，剪接體將內(nèi)含子移除后即形成circRNAs；后者2個內(nèi)含子通過堿基配對形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，內(nèi)含子移除或保留，形成相應的circRNAs。此外，還有RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)相關(guān)途徑，部分circRNAs是在RBP的調(diào)控下形成的，如QKI(Quaking)和Muscleblind(MBL)，RBP與內(nèi)含子序列結(jié)合后將兩側(cè)的內(nèi)含子側(cè)翼序列相連接，從而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，RBP水平與circRNAs的生物合成水平相關(guān)[7-8]。

2 circRNAs的特點及生物學功能

2.1 circRNAs的特點

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，circRNAs廣泛存在于多種組織中，不同組織中circRNAs的表達有明顯差異[9]。circRNAs為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺少5’端帽和3’端poly A尾，不易被核酸外切酶降解，故circRNAs具有高度穩(wěn)定性，這也是circRNAs可維持在較高豐度的原因之一[6]，部分circRNAs的豐度甚至超過線性RNA[4]。在哺乳動物中，大部分circRNAs在進化過程中有較強的保守性，5%～30%的環(huán)狀RNA完全保守[6]。

2.2 circRNAs的生物學功能

隨著circRNAs研究的深入，其生物學功能也慢慢被揭示，主要有以下主要功能。

2.2.1 miRNA“海綿”: 在細胞內(nèi)，部分circRNAs與長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)的功能相似，可通過與miRNAs的相互作用而發(fā)揮miRNA“海綿”功能，抑制miRNAs的功能，屬于競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)。較經(jīng)典的研究是ciRS-7與miR-7的結(jié)合，ciRS-7又稱CDR1as，已發(fā)現(xiàn)CDR1as上有超過70個miR-7結(jié)合位點，ciRS-7與miR-7結(jié)合后能促進miRNA與Argonaute(AGO)特異性結(jié)合，抑制miR-7的功能[10]。環(huán)形同源結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白激酶3(circular homeodomain-interacting protein kinase 3，circHIPK3)可與miR-124結(jié)合并抑制其作為腫瘤抑制因子的功能，調(diào)控細胞生長[11]。目前通過生物信息學技術(shù)找到的circRNA-miRNA的結(jié)合位點數(shù)量較少，也就是說大部分的circRNAs并不能作為miRNA“海綿”。

2.2.2 circRNAs與蛋白質(zhì)結(jié)合: 已有研究表明，circRNAs可與蛋白質(zhì)結(jié)合而影響蛋白質(zhì)功能。circFoxo3是由叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(Forkhead box O3，F(xiàn)oxo3)基因編碼的circRNA，在非癌細胞中呈高表達，circFoxo3可與細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent- kinase 2，CDK2)和p21結(jié)合，從而抑制細胞周期的進程[12]。circAmotl1可與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)和AKT絲/蘇氨酸激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1)結(jié)合，使AKT1磷酸化，對心血管疾患發(fā)揮預防作用[13]。

2.2.3 circRNAs對基因表達的調(diào)控功能: 大部分circRNAs位于細胞質(zhì)，但研究發(fā)現(xiàn)，部分circRNAs參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因表達，尤其是包含有內(nèi)含子的外顯子-內(nèi)含子circRNAs(EIciRNAs)可在細胞核中參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。Li等[14]報道顯示，EIciRNAs可通過RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，Pol Ⅱ)參與轉(zhuǎn)錄過程，特異性敲除環(huán)形真核翻譯起始因子3亞基J(circular eukaryotic transla-tion initiation factor 3 subunit J，circEIF3J)和環(huán)形多聚腺苷酸結(jié)合蛋白相互作用蛋白2(circular polyadenylate- binding protein-interacting protein 2，circPAIP2)后，EIF3J和PAIP2基因轉(zhuǎn)錄水平下降，認為circEIF3J和circPAIP2通過U1小核核糖核蛋白(small nuclear ribonucleic proteins，snRNP)構(gòu)成EIciRNA-U1 snRNP-Pol Ⅱ復合物，并作為基因啟動子促進基因表達。

2.2.4 circRNAs作為翻譯模板: circRNAs屬于非編碼RNA，隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明circRNAs可作為翻譯模板。通過計算機預測和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫分析對比發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)13%的circRNAs存在N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine，m6A)修飾，這些circRNAs可通過募集含YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白3(YTH domain-containing family protein 3，YTHDF3)來招募真核翻譯起始因子4 Fγ2(eukaryotic translation initiation factor 4F gamma 2，eIF4G2)蛋白和其他翻譯起始因子，啟動蛋白質(zhì)翻譯[15]。Legnini等[16]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_ZNF609是ZNF609基因第二外顯子獨自環(huán)化形成，在內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)驅(qū)動下以剪切依賴模式進行蛋白質(zhì)翻譯。Pamudurti等[17]發(fā)現(xiàn)果蠅體內(nèi)有大量內(nèi)源性circRNAs，其中大多數(shù)來源于蛋白編碼基因，并且含有完整的外顯子序列，通過核糖體印記數(shù)據(jù)進行CircRNAs挖掘，推測核糖體相關(guān)circRNAs具有蛋白編碼能力，且一系列實驗證明果蠅內(nèi)源性circRNAs具有編碼蛋白的能力。Zhang等[18]研究證明，來自SNF2 histone linker PHD RING helicase(SHPRH)基因的circ-SHPRH能夠編碼多肽，且該多肽是在跨過接口位點后終止翻譯的產(chǎn)物。

3 circRNAs與疾病的關(guān)系

3.1 circRNAs與癌癥

目前研究認為，由于circRNAs表達豐富且具有組織特異性，在低增生的組織或器官中也有較高的豐度，如腦組織、血液等，具有穩(wěn)定性高且高度保守的特點，可作為癌癥診斷和預后的潛在生物標志物。在胃癌中hsa_circ_0000096、circPVT1、hsa_circ_002059等circRNAs表達有差異[19-21]，肝癌中hsa_circ_0001649等circRNAs差異表達明顯[22]。隨著ncRNA網(wǎng)絡(luò)研究的深入，認為circRNAs可通過miRNAs或蛋白質(zhì)而參與腫瘤免疫過程。circAmotl1可使miR-17啟動子甲基化而抑制miR- 17的表達，促進在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用的信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的表達[23]，在結(jié)腸癌中hsa_circ_0020397通過與miR-138的結(jié)合而抑制miR-138活性，從而增加端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和PD-L1的表達[24]。

3.2 circRNAs與其他疾病

在哺乳動物腦組織中circRNAs含量高于其他組織，研究發(fā)現(xiàn)，ciR-7作為miR-7“海綿”而調(diào)控miR-7靶基因的表達，如表皮生長因子受體基因、SNCA基因、胰島素受體底物2基因、α-突觸核蛋白基因[10]和泛素結(jié)合酶E2A基因[25]，參與帕金森病和阿爾茨海默病的發(fā)生。隨著芯片技術(shù)和二代測序技術(shù)的進步，研究人員發(fā)現(xiàn)其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展也與circRNAs相關(guān)，如多系統(tǒng)萎縮癥、腦缺血再灌注損傷。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管功能障礙中circHIPK3(has_circ_0000284)水平顯著升高，深入研究后發(fā)現(xiàn)circHIPK3可競爭性地結(jié)合miR-30a，調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C ，VEGFC)、卷曲受體4(frizzled class receptor 4，F(xiàn)ZD4)和Wnt 家族成員2(Wnt family member 2，WNT2)基因，在糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管功能障礙中發(fā)揮作用[26]。

4 circRNAs與AD

研究發(fā)現(xiàn)，has_circ_100783在CD8+T細胞中過表達，且可通過調(diào)控磷蛋白相關(guān)通路與衰老相關(guān)的CD8+T細胞的CD28受體的缺失有關(guān)[27]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應中觀察到mmu_circ_000790顯著上調(diào)，干擾其表達，抑制巨噬細胞分泌白細胞介素(interleukin 6，IL-6)。據(jù)此，作者推測mmu_circ_000790通過競爭性地結(jié)合調(diào)控IL-6基因表達的miRNA而影響該miRNA對IL-6的負性調(diào)控[28]。

AD是一組病因未明的慢性炎癥性疾病，其特點是自身反應T、B淋巴細胞過度活化，產(chǎn)生大量自身抗體，造成多系統(tǒng)、多器官的廣泛損害。目前，AD的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明。既往研究表明，AD可能與遺傳、環(huán)境、感染等因素有關(guān)，在特定的遺傳背景和環(huán)境因素下，機體的自身免疫系統(tǒng)異常激活，造成免疫耐受缺失，引起免疫細胞功能異常，這是導致AD組織損傷的主要原因。關(guān)于AD相關(guān)miRNAs的研究發(fā)現(xiàn)，AD的典型表觀遺傳機制是miRNAs對基因的調(diào)控。部分miRNAs與自身免疫過程相關(guān)，包括T、B淋巴細胞的激活、炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生及自噬現(xiàn)象等[29-31]。在類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)[32-33]、干燥綜合征(Sj?gren syndrome，SS)[34]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)[35-36]、原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)[37]等AD中已發(fā)現(xiàn)數(shù)種miRNAs的表達變化，這些變化參與疾病的發(fā)生和發(fā)展。circRNAs在功能上可作為miRNA“海綿”，即circRNAs的表達變化可能影響miRNAs的螯合能力，進而導致miRNAs基因靶點的改變，達到調(diào)控基因表達的目的。circRNAs在AD的發(fā)生和發(fā)展中是否發(fā)揮作用值得探究。目前，關(guān)于circRNAs在AD中作用的研究正在進行中[38]。Li等[39]對6例SLE患者及6位健康對照者的血漿樣本行circRNAs芯片檢測，并對差異表達的circRNAs進行分析，發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿中顯著下調(diào)的hsa_circ_100226可與miR-138-5p、miR-145-3p、miR-24-3p、miR-620及miR-875-3p結(jié)合，其中miR-138-5p可促進腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導的細胞凋亡，即hsa_circ_100226可通過miR-138-5影響細胞凋亡。此外作者認為SLE患者顯著下調(diào)的circRNAs有可能成為SLE潛在生物學標志物，包括hsa_circ_102584、hsa_circ_400011、hsa_circ_101471和 hsa_circ_100226。研究還發(fā)現(xiàn)與健康人相比，SLE患者外周血T細胞存在127個差異表達的circRNAs，在Jurkat細胞中特異性敲低 hsa_circ_0045272可使Jurkat 細胞早期凋亡增加，同時Jurkat 細胞分泌的IL-2增加，推測SLE患者中hsa_circ_0045272發(fā)揮負性調(diào)控細胞凋亡及IL-2分泌的作用[40]。宋新強等[41]采用circRNAs芯片技術(shù)分析RA患者全血細胞差異表達的circRNAs并與健康者進行比較，然后對這些circRNAs涉及的基因做基因本體(gene ontology，GO)分析，結(jié)果表明相關(guān)差異表達基因的功能主要涉及生物學調(diào)控、細胞分化、代謝等過程，但與前人發(fā)現(xiàn)的RA致病基因(HLA-DRB1、HLA-A、HLA-DPB1、PADI4、PT-PN22、CTLA4、FCRL3、IL2/IL21、STAT4、TNFAIP3、TRAF1/C5等)沒有重疊，因此作者認為circRNAs可能參與RA發(fā)病的調(diào)節(jié)，而不是直接致病。Ouyang等[42]將RA患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中差異表達的circRNAs與健康人進行比較，發(fā)現(xiàn) circRNAs與RA患者病情活動度及炎癥指標(DAS28、CRP、ESR、HAQ)間的相關(guān)性無統(tǒng)計學意義，但hsa_circ_104871、hsa_circ_003524、hsa_circ_101873和hsa_circ_103047對RA有潛在的診斷價值，其中hsa_circ_104871對RA的診斷價值最高，但仍需要深入研究加以驗證。Zheng 等[43]采用芯片分析法對RA患者PBMC的circRNAs與健康人進行比較，發(fā)現(xiàn)數(shù)個差異表達的circRNAs所在基因可能都與RA的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Zheng等[44]對原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)患者血漿中差異表達的circRNAs與健康對照者進行比較，發(fā)現(xiàn)未接受熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)治療的患者血漿中hsa_circ_402458表達明顯上調(diào)，根據(jù)受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析結(jié)果，hsa_circ_402458為PBC的最佳標志物。

5 總結(jié)與展望

circRNAs是近年來備受關(guān)注的ceRNA，在許多領(lǐng)域都展現(xiàn)出其獨特作用，研究認為circRNAs穩(wěn)定性及保守性高，在機體的組織和體液中有較高豐度，且參與疾病的發(fā)生及發(fā)展，可作為疾病診斷的潛在生物標志物，尤其是circRNAs與腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移等病理過程相關(guān)。雖然目前對于circRNAs的形成機制及其功能的研究還十分有限，僅揭示了少數(shù)circRNAs的功能和機制，但已確定circRNAs在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前，與AD相關(guān)的circRNAs研究主要聚焦于其異常表達及作為疾病診斷標志物領(lǐng)域，這僅是circRNAs研究的冰山一角，circRNAs在AD的發(fā)病及進展中究竟如何發(fā)揮調(diào)控作用仍亟待研究。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展、對circRNAs與多種疾病關(guān)系的認識及circRNAs作用機制研究的不斷深入，circRNAs在AD的診斷、預后和治療中具有良好的應用前景。