靛玉紅對神經(jīng)膠質瘤細胞U251的增殖抑制及Bcl-2表達的影響*

張 濤，易昊天，王幫華，王澤夏，寧志豐，胡美純

(湖北科技學院基礎醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究中心，湖北 咸寧 437100)

神經(jīng)膠質瘤是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率最高的原發(fā)性惡性腫瘤，其高死亡率嚴重危害人類健康[1-2]。神經(jīng)膠質瘤對放化療具有較強的耐受性，治療效果差，且治療后易復發(fā)，患者中位生存期不足1 年[3-4]。靛玉紅(Indirubin)是從中藥青黛(Indigofera tinctoria L)中分離出來的有效成分，為一雙吲哚類小分子化合物。已有研究表明[5]靛玉紅對人乳腺癌細胞、人結腸癌細胞、人體鼻咽癌細胞等多種惡性腫瘤均具有明顯的抑制作用，其作用機制可能是抑制DNA和蛋白質的合成。目前，靛玉紅因其具有毒性低、副作用小、對多種腫瘤具有較好的抑制作用等抗癌特性，臨床上已被批準用于治療慢性粒細胞白血病。然迄今為止，靛玉紅在神經(jīng)膠質瘤方面的抑制作用卻鮮有報道。Williams與Lawler等曾報道過靛玉紅對神經(jīng)膠質瘤細胞遷移的抑制[6]，但關于靛玉紅對神經(jīng)膠質瘤細胞增殖的影響尚無人報道。本研究發(fā)現(xiàn)靛玉紅抑制神經(jīng)膠質瘤的增殖并通過下調(diào)Bcl-2起作用，為靛玉紅治療神經(jīng)膠質瘤的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞：正常人腦星型膠質細胞HEB及人多形性膠質母細胞瘤細胞U251購自ATCC。主要試劑：MTT和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)、Tris堿、甘氨酸(glycine)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、牛血清白蛋白、甘油、甲醇、溴酚藍、40%丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)等試劑購自上海生工生物；NC膜(Millipore)、過硫酸銨(Sigma-Aldrich)、胎牛血清(Gibco)、100X青霉素+鏈霉素混合液P/S (Invitrogen)、胰蛋白酶trypsin+0.25% EDTA (Hyclone)、免疫組化試劑盒 (上海明睿生物技術有限公司)，來源于兔的抗Bcl-2的多克隆抗體(YY0032R，Abbkine)，來源于小鼠的抗β-Actin的單克隆抗體(#A5441，Sigma-Aldrich)；靛玉紅購買自南京澤朗生物科技有限公司(HPLC檢測純度 98%以上)。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法檢測靛玉紅對U251細胞增殖的抑制作用

收集對數(shù)期U251及HEB細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100μL鋪板使細胞密度為5000個/孔。5%CO2，37℃孵育至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入經(jīng)DMSO溶解的濃度分別為0、5、10、20、50μM的靛玉紅處理48h。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4h。PBS沖洗2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液終止培養(yǎng)。每孔加入150μL DMSO使碘硝基四唑甲臜結晶充分溶解。酶標儀于490nm處測量各孔的吸光值OD。以靛玉紅濃度0μM為對照組，后續(xù)所有實驗均按此原則進行。細胞存活率=(實驗組OD-對照組OD)/(對照組OD)，設定對照組存活率為1。實驗組存活率與之相比，小于1，藥物有抑制增殖作用；大于1，藥物有促進增殖作用。實驗均重復3次以上。

1.2.2 Western blot檢測靛玉紅作用后Bcl-2的表達量

靛玉紅處理好的細胞用加強型RIPA lysis buffer裂解蛋白，具體方法為，細胞用預冷PBS洗滌兩遍，加入適合體積的裂解液將細胞充分刮下，置于冰上裂解15min。4℃12,000rpm離心15min，收集上清。BCA蛋白定量。加入5X SDS-loading buffer于100℃煮沸10min后進行蛋白電泳。一抗過夜。二抗孵育1h。Odyssey成像系統(tǒng)掃膜，分析結果。

1.2.3 免疫組化分析靛玉紅干預后皮下腫瘤中Bcl-2的表達水平

將U251細胞皮下注射到免疫缺陷小鼠(裸鼠)背部皮下，待皮下腫瘤長到100mm3左右將小鼠分為藥物干預組和對照組，實驗共采用20只小鼠，每組各10只：動物實驗所用的藥物劑量按mg/kg體重計算，經(jīng)稱量小鼠平均體重為25g，應用時從已知藥液的濃度換算出相當于每mg體重應注射的藥液量，以便給藥。實際每只小鼠每天腹腔注射藥物100μL。干預組小鼠腹腔注射靛玉紅劑量20mg/(kg·d)；對照組小鼠腹腔注射等體積的100μL DMSO。待30d后實驗結束時剝離皮下腫瘤組織塊，免疫組化方法按照試劑盒說明書進行。DAB顯色5min。蘇木精染色5min。1%鹽酸酒精分色10s，自來水沖洗返藍10min。脫水，透明，封片，鏡檢，拍照。干預組和對照組的每張切片計數(shù)4個高倍視野的棕黃色染色細胞為陽性細胞，然后得出均值做為每張切片的陽性細胞數(shù)，將實驗組的陽性細胞個數(shù)與對照組的陽性細胞個數(shù)進行百分比即為陽性相對表達量。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 靛玉紅抑制神經(jīng)膠質瘤細胞增殖

圖1(封二)的細胞存活實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)靛玉紅處理的U251細胞增殖活性顯著下降。隨著靛玉紅給藥濃度的升高，U251細胞的存活率逐漸下降。在給藥濃度為20 μM時，細胞存活率降低了約62%。在最大濃度50 μM時，細胞相對存活率下降了85%以上，說明靛玉紅對腫瘤細胞具有明顯的殺傷效果，而對正常細胞HEB的毒性較低。即使是在最大濃度50 μM時，靛玉紅對正常細胞的存活下降率仍不足20%，這說明靛玉紅在正常細胞及腫瘤細胞之間具有較好的選擇性。

2.2 靛玉紅下調(diào)體外細胞Bcl-2蛋白表達水平

不同濃度的靛玉紅處理U251細胞后檢測Bcl-2蛋白表達水平，結果如圖2(封二)所示。Bcl-2隨著靛玉紅濃度的增加而逐漸下降(圖2A)，至靛玉紅濃度為20μM時為最低。圖2B為根據(jù)圖2A的結果所進行的灰度值統(tǒng)計分析，由圖可見20μM時Bcl-2的蛋白濃度下降了75%以上。以上結果初步證明靛玉紅可下調(diào)Bcl-2的表達。

2.3 靛玉紅降低體內(nèi)腫瘤Bcl-2陽性表達率

在U251裸小鼠皮下腫瘤模型中進行靛玉紅腹腔注射。劑量為20 mg/(kg·d)的靛玉紅顯著降低皮下腫瘤的生長。剝離腫瘤組織行免疫組化，圖3A(封二)的結果顯示，對照組(0μM)中，棕黃色的附性細胞明顯多于實驗組(20μM)的陽性細胞數(shù)。圖3B(封二)為根據(jù)圖3A的結果進行的Bcl-2蛋白陽性表達率分析，當對照組陽性表達率為100%時，實驗組的陽性表達率僅為25%，兩組間的陽性表達率呈顯著性差異(P<0.01)。提示靛玉紅在體內(nèi)具有下調(diào)Bcl-2蛋白表達的功能。

3 討 論

與傳統(tǒng)藥物相比，小分子靶向藥物具有副作用更小、特異性更高以及藥效更高等優(yōu)勢，目前是神經(jīng)膠質瘤藥物治療的研究熱點[7]。傳統(tǒng)神經(jīng)膠質瘤治療采用放化療結合的方法，這對正常細胞的損傷較大，且患者到中后期會出現(xiàn)許多不良反應。分子靶向治療有望克服上述不足，在神經(jīng)膠質瘤治療方面將得到廣泛應用。甲磺酸伊馬替尼(Gleevec)，第一個小分子靶向藥物于2001 年被FDA批準上市后，陸續(xù)有許多小分子靶向藥物如阿法替尼(afatinib)、色瑞替尼(cerritinib)等被發(fā)現(xiàn)[8-9]。研發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權的抗神經(jīng)膠質瘤靶向藥物對于延長神經(jīng)膠質瘤患者生命具有重要意義。

U251是一株高度惡性的神經(jīng)膠質瘤細胞，常作為研究的理想細胞模型。Bcl-2蛋白的異常高表達與多種腫瘤的進展相關，在細胞存活過程中起關鍵作用。以Bcl-2蛋白家族為靶點設計抗腫瘤藥物已成為藥物開發(fā)領域的廣泛策略。本研究結果顯示，靛玉紅對神經(jīng)膠質瘤具有顯著抑制作用；Western blot及免疫組化結果顯示靛玉紅通過下調(diào)Bcl-2對神經(jīng)膠質瘤起抑制作用。然而，靛玉紅是否通過與Bcl-2直接作用抑制神經(jīng)膠質瘤尚未得到證實。關于Bcl-2蛋白水平的降低，我們猜想有更多種可能的分子機制參與其中：靛玉紅是通過上游轉錄水平下調(diào)Bcl-2的mRNA從而降低了Bcl-2的表達量？亦或靛玉紅有可能直接促進Bcl-2的降解？這些深入的分子機制有待本課題組進一步探討。

總之，本研究在細胞模型及動物模型基礎上明確了靛玉紅對神經(jīng)膠質瘤的抑制作用，重點研究了靛玉紅對Bcl-2蛋白表達量的效果，初步探討了靛玉紅抑制神經(jīng)膠質瘤的分子機制。本研究結果有望為以靛玉紅為先導化合物的一類新型小分子化合物治療神經(jīng)膠質瘤提供理論支持，為抗神經(jīng)膠質瘤的新藥研發(fā)工作奠定基礎。

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