脂多糖在創(chuàng)傷性顱腦損傷炎癥反應(yīng)中的作用

樊友道 尹海斌 楊勇 張旺明

(佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院，廣東 佛山 528244)

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury, TBI)是神經(jīng)外科中最常見的疾病，在工業(yè)和交通運輸業(yè)較為發(fā)達的地區(qū)，其發(fā)病率和致殘率依然很高。在美國，每十萬人群中入院的閉合性顱腦損傷約有200例，開放性顱腦損傷約有12例[1]。我國每年約60萬例發(fā)生顱腦損傷，其中10萬例左右死亡[2]。目前認(rèn)為炎性細(xì)胞因子是TBI病理生理過程中的一個重要組成環(huán)節(jié)，由于炎性反應(yīng)的復(fù)雜性和炎性細(xì)胞因子的多樣性，在顱腦損傷中，炎癥究竟與腦水腫形成、繼發(fā)性腦缺血、神經(jīng)細(xì)胞死亡、顱內(nèi)壓增高有何種因果關(guān)系仍不確定[3]。當(dāng)前TBI中炎性細(xì)胞因子﹝細(xì)胞因子(cytokines, CK)﹞表達正成為學(xué)者們關(guān)注的熱點問題。

一、對象與方法

1.一般資料：選取2010年9月至2014年9月間來本院就診的創(chuàng)傷性顱腦損傷的患者36例進行回顧性研究，其中男性患者為21例，女性患者為 15例，年齡為21～78歲，平均年齡為(46.5±7.6)歲。將所有患者根據(jù)格拉斯哥昏迷評分(GCS)分值分為輕度、中度、重度顱腦損傷組，每組12例患者，并且選取同期來本院進行體檢的健康者12例作為對照組。

2.納入條件：傷后24 h內(nèi)入院；經(jīng)頭顱CT掃描確診；無其他部位嚴(yán)重合并傷；無休克等嚴(yán)重并發(fā)疾病。

3.試劑：腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測試劑盒購買自美國Raybiotech公司。其余試劑均為分析純。

4.儀器：臺式離心機、酶標(biāo)儀(德國Thermo公司)；-20 ℃冰箱(海爾)；紫外分光光度計(上海精科公司)；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(蘇州江東精密儀器)；

5.樣本采集：在所有患者傷后1、2、3、5、7、14 d分別采集外周靜脈血3 mL，室溫下3000 r/min離心15 min去上清液，將血清存放于-20 ℃冰箱中待測。并在征得來本院體檢的健康者同意，分別采集外周靜脈血3 mL，同樣在室溫下3000 r/min離心15 min去上清液，將血清存放于-20 ℃冰箱中待測。

6.ELISA檢測：使用ELISA方法檢測研究對象血清中TNF-α和IL-6水平。步驟如下：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10 μg/mL，每孔加0.1 mL，4 ℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品0.1 mL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h，洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗抗體0.1 mL，37 ℃孵育30～60 min，洗滌，最后一遍用DDW洗滌。加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)底物溶液0.1 mL，37 ℃ 10～30 min。終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸0.05 mL。結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。測光密度(optical density, OD)值：在酶標(biāo)儀上，于450 nm處，若以2, 2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)顯色，則410 nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

7.GREISS檢測：將血清樣本各取0.1 mL，加入等體積的GREISS試劑(1%磺胺、0.1%萘乙二胺、2.5%磷酸)，使用移液器吹打混勻后放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，水浴培養(yǎng)1 h，隨后用紫外分光光度計在548 nm光波長處進行檢測。

二、結(jié)果

1.患者基本資料：對3組患者及對照組健康者的基本情況進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，輕、中、重度及對照組男性例數(shù)分別為7、8、7、5例，而女性分別為5、4、5、5例，3個研究組及對照組的平均年齡分別為：(44.5±6.4)歲、(46.7±7.2)歲、(45.8±5.7)歲、(46.3±6.3)歲。三個組之間例數(shù)、性別及平均年齡構(gòu)成比較差異不顯著(P>0.05)。表明3個研究組及對照組具有一定的可比性。對3組患者的病理類型進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，輕、中、重度單純腦挫傷例數(shù)分別為2、1、1例，單純硬膜下血腫分別為3、3、3例，顱內(nèi)多發(fā)血腫分別為3、3、4例，單純實質(zhì)內(nèi)血腫分別為1、2、2例，其他別為3、3、2例。三組患者均以單純硬膜下血腫和顱內(nèi)多發(fā)血腫病例最多，而3組間病理類型的構(gòu)成比較比較差異不顯著(P>0.05)。

2.患者血清中TNF-α和IL-6水平：對3組患者及對照組健康者的血清中TNF-α和IL-6濃度進行檢測，結(jié)果顯示，重度損傷組、中度損傷組患者1、2、3、5、7、14 d的血清中TNF-α和IL-6濃度與對照組比較差異均顯著(P<0.05)。輕度損傷組患者1、2、3、5、7 d的血清中TNF-α和IL-6濃度與對照組比較差異均顯著(P<0.05)。而輕度損傷組患者14 d的血清中TNF-α濃度和IL-6與對照組比較差異不顯著(P>0.05)。詳細(xì)結(jié)果見表1和表2。

3.患者血清中NO水平：對3組患者及對照組健康者的血清中NO濃度進行檢測，結(jié)果顯示，重度損傷組患者1、2、3、5、7、14 d的血清中NO濃度與對照組比較差異均顯著(P<0.05)。輕度損傷組、中度損傷組患者1、2、3、5、7 d的血清中NO濃度與對照組比較差異均顯著(P<0.05)。而輕度損傷組、中度損傷組患者14 d的血清中NO與對照組比較差異均不顯著(P>0.05)。詳細(xì)結(jié)果見表3。

組別1d2d3d5d7d14d 輕度損傷組211．3±7．1a215．3±7．8a192．4±7．6a177．9±8．1a159．7±7．9a146．5±7．8 中度損傷組226．4±6．5a231．2±7．6a234．2±7．4a223．4±8．5a194．7±8．4a179．8±7．6a 重度損傷組248．6±7．6a256．3±8．9a269．4±9．7a245．8±8．3a219．6±9．2a203．4±8．7a 對照組138．7±9．4142．6±7．6134．7±5．5131．9±8．5132．7±4．9134．2±4．3

aP<0.05,vs對照組.

表2 患者血清中IL-6濃度(pg/mL)

組別1d2d3d5d7d14d 輕度損傷組184．3±7．7a186．2±8．4a176．4±9．2a161．3±7．8a153．4±6．7a131．6±8．4 中度損傷組204．5±12．4a207．5±9．6a208．1±11．3a201．6±8．7a186．7±7．9a154．7±8．2a 重度損傷組217．8±9．6a224．7±12．4a237．4±13．5a215．8±9．1a204．3±9．4a176．3±9．7a 對照組125．4±11．2124．7±5．3126．9±5．8128．7±2．4125．5±7．6127．3±7．2

aP<0.05,vs對照組.

表3 患者血清中NO濃度(nmol/mL)

組別1d2d3d5d7d14d 輕度損傷組38．6±5．8a39．2±5．7a37．1±7．2a34．7±6．4a31．7±5．6a30．4±6．7 中度損傷組44．7±6．5a45．8±6．6a46．2±8．4a43．1±8．2a38．9±6．8a32．1±7．3 重度損傷組48．9±6．7a49．2±7．8a51．3±8．9a46．5±7．3a41．3±7．6a38．4±6．9a 對照組29．4±5．628．5±4．329．1±4．228．9±5．829．2±7．528．9±4．6

aP<0.05,vs對照組.

三、討論

骨折造成顱內(nèi)損傷在現(xiàn)代社會較為常見[4]，腦部受到創(chuàng)傷后繼發(fā)炎癥損傷[5]。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia, MG)是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)各部位的一類重要的免疫細(xì)胞，是具有免疫和炎癥雙重功能的膠質(zhì)細(xì)胞。參與腦內(nèi)的固有免疫反應(yīng)，構(gòu)成CNS抵御病原體入侵的第一防線。在CNS的各種病理過程中，MG可被激活，釋放炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、IL-6、一氧化氮(nitric oxide, NO)，并且具有機械吞嗟的功能[6]。雖然MG和星形膠質(zhì)細(xì)胞已被確定為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞因子(cytokine, CK)的來源，但卻是MG而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞是關(guān)鍵CK的主要來源[7]。據(jù)報道，體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞在脂多糖(lpopolysaccharide, LPS )的作用下可以被激活而釋放IL-1β、TNF-α以及其他多種炎性分子[8]。

本研究中，3組患者的血清中TNF-α、IL-6、NO水平比對照組明顯升高，顯示在創(chuàng)傷性顱腦損傷炎癥反應(yīng)中脂多糖起到促進TNF-α、IL-6、NO分泌的作用，而已知的研究顯示，TNF-α、IL-6在創(chuàng)傷性顱腦損傷炎癥反應(yīng)的急性和高峰期表達水平最高，這也說明TNF-α、IL-6對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的二次打擊密切相關(guān)。這對臨床治療、預(yù)后觀察及臨床診斷提供了新的指標(biāo)。為臨床后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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