miR- 489通過調(diào)控TWIST1的表達(dá)抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞表型和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換

任 莉，厲英超，賈 皚，張 麗，米 琛

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 陜西 西安 710061)

研究論文

miR- 489通過調(diào)控TWIST1的表達(dá)抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞表型和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換

任 莉*，厲英超，賈 皚，張 麗，米 琛

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 陜西 西安 710061)

目的探討miR- 489在結(jié)腸癌干細(xì)胞表型和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換中的作用和調(diào)控機制。方法RT-qPCR檢測多個人結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT29、SW480、SW620和HCT116)和正常腸道上皮細(xì)胞HIEC中miR- 489表達(dá)；采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)提高結(jié)腸癌細(xì)胞中miR- 489表達(dá)，Western blot檢測過表達(dá)miR- 489對結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44、EpCAM、ALDH1和上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin和N-cadherin的表達(dá)；RT-qPCR和Western blot檢測TWIST1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果4個結(jié)腸癌細(xì)胞系中的miR- 489相對表達(dá)量顯著低于正常腸道上皮細(xì)胞HIEC中的表達(dá)(P<0.05)。在HT29和HCT116細(xì)胞中過表達(dá)miR- 489，4個結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)降低(P<0.05)；上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增加(P<0.05)；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)減少(P<0.05)。TWIST1是miR- 489潛在靶基因，在2個細(xì)胞系中過表達(dá)miR- 489，TWIST1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。結(jié)論miR- 489在結(jié)腸癌細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miR- 489可能通過調(diào)控TWIST1抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞表型和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。

miR- 489；TWIST1；結(jié)腸癌；腫瘤干細(xì)胞；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換

結(jié)腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，在中國的發(fā)病率逐年上升[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchy-mal transition,EMT)的主要特征是上皮細(xì)胞的特性喪失，而間質(zhì)細(xì)胞的特性獲得，從而使細(xì)胞獲得遷移與侵襲能力，是腫瘤轉(zhuǎn)移以及治療失敗的主要原因之一[2]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSCs)是腫瘤內(nèi)一小部分具有多向分化、自我更新和無限增殖潛能的干細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。miR- 489是微小RNA分子重要一員。研究表明，miR- 489作為抑癌基因，在胰腺癌[3]、乳腺癌[4]和胃癌[5]中均低表達(dá)，其與EMT屬性、腫瘤耐藥性和CSCs表型密切相關(guān)。目前關(guān)于miR- 489在結(jié)腸癌中的表達(dá)及與結(jié)腸癌干細(xì)胞表型和EMT的關(guān)系尚不清楚，本研究對結(jié)腸癌中miR- 489表達(dá)、EMT過程和CSCs特性獲得的具體關(guān)系和相關(guān)分子機制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT29、SW480、SW620和HCT116)和正常腸道上皮細(xì)胞HIEC(ATCC公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、抗CD133、CD44、EpCAM、ALDH1、E-cadherin、vimentin、N-cadherin、TWIST1抗體以及通用二抗(Invitrogen公司)；Trizol試劑盒、miRNeasy Mini Kit試劑盒、RT-PCR試劑盒、脂質(zhì)體miR- 489 mimics和LipofectamineTM2000(Qiagen公司)；hsa-miR- 489及其內(nèi)參U6引物、TWIST1引物(上海吉瑪生物公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代：將人結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT29，SW480，SW620，HCT116)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基，正常腸道上皮細(xì)胞HIEC培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、飽和濕度、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞匯合度達(dá)80%時采用胰蛋白酶消化，傳代2～3次，取對數(shù)期增殖的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 RT-qPCR檢測mRNA：用RT-qPCR檢測miR- 489和TWIST1 mRNA含量，細(xì)胞良好后棄培養(yǎng)基，將各人結(jié)腸癌細(xì)胞系和正常腸道上皮細(xì)胞加入Trizol快速裂解細(xì)胞，提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以以cDNA作為模板，U6 RNA為對照，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸34 s，擴增40個循環(huán)。計算Ct值，并計算△Ct。收集轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞，按上述方法提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR法檢測細(xì)胞內(nèi)TWIST1 mRNA表達(dá)。miR- 489、TWIST1 mRNA相對表達(dá)量=2-△△Ct。

1.2.3 miR- 489 mimics轉(zhuǎn)染：選擇人結(jié)腸癌細(xì)胞系中較低表達(dá)的2種，接種于6孔板中，培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)50%左右，分兩組，mimics組加入100 pmol/L miR- 489 mimics+5 μL LipofectamineTM2000，對照組加等量陰性對照mimics和5 μL LipofectamineTM2000，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.4 Western blot檢測蛋白：收集轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次后加入RIPA裂解液至充分裂解，冰上操作；離心后采用BCA法測定總蛋白濃度。將蛋白樣品以5∶1比例加入6×上樣緩沖液，煮沸5 min，12% SDS-PAGE。預(yù)制5% TBS-脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的CD133、CD44、EpCAM、ALDH1、E-cadherin、vimentin、N-cadherin、TWIST1一抗或GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，加入1∶5 000稀釋的通用二抗，室溫孵育1 h。ECL液顯色并膠片曝光，洗片后分析各蛋白表達(dá)量。蛋白表達(dá)量以目的蛋白/內(nèi)參的吸光度值比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR- 489在結(jié)腸癌細(xì)胞和正常腸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)

4種結(jié)腸癌細(xì)胞miR- 489相對表達(dá)量顯著低于正常腸道上皮細(xì)胞(P<0.05)(圖1)。4種結(jié)腸癌細(xì)胞中HT29和HCT116最低，選擇這2種細(xì)胞系用作后續(xù)實驗研究。

2.2 過表達(dá)miR- 489對結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物的影響

HT29(圖2A)和HCT116(圖2B)細(xì)胞中結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平在mimics組顯著低于對照組(P<0.05)。

2.3 過表達(dá)miR- 489對結(jié)腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響

HT29(圖3A)和HCT116(圖3B)細(xì)胞中結(jié)腸癌上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin在mimics組顯著高于對照組， 間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin和N-cadherin顯著低于對照組(P<0.05)。

*P<0.05 compared with HIEC圖1 miR- 489在結(jié)腸癌細(xì)胞和正常腸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig 1 Expression of miR- 489 in colon cancer cell lines and normal intestinal epithelial cell(±s, n=3)

2.4 miR- 489靶基因

Targetscan檢索發(fā)現(xiàn)TWIST1是miR- 489潛在靶基因(圖4)。

A.HT29 cell line; B.HCT116 cell line; *P<0.05 compared with control圖2 過表達(dá)miR- 489對結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物的影響Fig 2 Influence of up-regulation of miR- 489 expression on colon cancer stem cell markers(±s, n=3)

A.HT29 cell line; B.HCT116 cell line; *P<0.05 compared with control圖3 過表達(dá)miR- 489對結(jié)腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響

圖4 miR- 489潛在靶基因檢索Fig 4 Retrieval of potential target genes of miR- 489

2.5 過表達(dá)miR- 489對TWIST1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

過表達(dá)miR- 489，HT29(圖5A)和HCT116(圖5B)細(xì)胞中TWIST1 mRNA在mimics組表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.05)；HT29(圖6A)和HCT116(圖6B)細(xì)胞中TWIST1蛋白表達(dá)水平在mimics組顯著低于對照組(P<0.05)。

A.HT29 cell line; B.HCT116 cell line; *P<0.05 compared with control圖5 過表達(dá)miR- 489對TWIST1 mRNA表達(dá)的影響Fig 5 Influence of up-regulation of miR- 489 expression

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌預(yù)后的最主要影響因素，是一個復(fù)雜的過程，依賴于miRNAs、CSCs、EMT等多重因素作用。EMT可以讓細(xì)胞獲得遷移與侵襲能力，從而逃逸原發(fā)部位進(jìn)入淋巴管和血管并形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，還可以繼續(xù)重復(fù)EMT過程形成更多新的病灶。目前關(guān)于CSCs存在較多爭議，腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤起源于CSCs， 但也有研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞通過EMT過程即可獲得侵襲能力更強的細(xì)胞和CSCs特性。可以肯定的是，實體腫瘤內(nèi)存在CSCs，且在結(jié)腸癌中分離出了結(jié)腸癌CSCs[6]。

A.HT29 cell line; B.HCT116 cell line; *P<0.05 compared with control圖6 過表達(dá)miR- 489對TWIST1 蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Influence of up-regulation of miR- 489 expression on TWIST1 protein(±s, n=3)

目前關(guān)于miR- 489在腫瘤中的作用研究具有兩面性，其主要作為抑癌基因在多種腫瘤中低表達(dá)。例如miR- 489作為抑癌基因靶向調(diào)控PROX1抑制胃癌生長[5]。miR- 489與EMT和CSCs特性有關(guān)，miR- 489能夠調(diào)控靶基因Smad3和Smad3相關(guān)EMT屬性影響乳腺癌耐藥性[7]。而具有較高轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌類型與CSCs標(biāo)志物和EMT標(biāo)志物密切相關(guān)[8]。因此，推測miR- 489、CSCs和EMT是結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的重要因素，且存在某種聯(lián)系。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種人結(jié)腸癌細(xì)胞系miR- 489相對表達(dá)量顯著低于正常腸道上皮細(xì)胞HIEC。表明miR- 489在結(jié)腸癌中低表達(dá)，可能發(fā)揮抑癌基因作用。進(jìn)一步研究miR- 489與CSCs和EMT的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR- 489能夠抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞表型和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。

miRNAs主要與靶基因的3′-非翻譯區(qū)進(jìn)行互補配對通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，單個miRNA可以作用于多個靶基因。理論上miR- 489的有數(shù)個乃至數(shù)十個，但被驗證的仍然較少。堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控真核生物生長發(fā)育較為重要的一類轉(zhuǎn)錄因子大家族。TWIST是bHLH家族成員之一，包括TWIST1和TWIST2兩種亞型，新近研究發(fā)現(xiàn)，TWIST1是一種癌基因，是EMT的關(guān)鍵基因，參與EMT全過程，并影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷移和侵襲[9]。TWIST1通過上調(diào)間充質(zhì)表型表達(dá)，抑制上皮樣結(jié)構(gòu)表型促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[10]。通過過表達(dá)TWIST1可以降低上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，并提高間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin和N-cadherin表達(dá)，誘導(dǎo)EMT過程并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果表明，TWIST1可能是miR- 489的靶點，過表達(dá)miR- 489可能通過調(diào)控TWIST1抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞表型和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。

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miR- 489 inhibits the stem cell phenotype and epithelial-mesenchymal transition of colon cancer by regulating the expression of TWIST1

REN Li*, LI Ying-chao, JIA Kai, ZHANG Li, MI Chen

(Dept. of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiao Tong University, Xi’an 710061, China)

ObjectiveTo explore the effects and regulation mechanism of miR- 489 on the stem cell phenotype and epithelial-mesenchymal transition of colon cancer cellsinvitro.MethodsThe miR- 489 expression of colon cancer cell lines (HT29, SW480 and SW620, HCT116) and normal intestinal epithelial cells HIEC were detected by RT-qPCR, the miR- 489 expression in colon cancer cells was raised by gene transfection technology, the colon cancer stem cell markers CD133, CD44, EpCAM, ALDH1 and epithelial marker E-cadherin, mesenchymal cells markers vimentin and N-cadherin were detected by Western blot. The expression of TWIST1 mRNA and protein were detected by RT-qPCR and Western blot.ResultsThe miR- 489 relative expression in four kinds of colon cancer cells (HT29, SW480 and SW620, HCT116) were significantly lower than that of normal HIEC intestinal epithelial cells, the difference was statistically significant (P<0.05). Up-regulation of miR- 489 expression in HT29 and HCT116 cells leaded to lower expression of colon cancer stem cell marker CD133, CD44, EpCAM ALDH1 and mesenchymal cells markers Vimentin, N-cadherin, higher expression of epithelial markers E-cadherin (P<0.05). Also, up-regulation of miR- 489 expression in HT29 and HCT116 cells leaded to lower expression of TWIST1 mRNA and protein (P<0.05).ConclusionsmiR- 489 is down-regulated in colon cancer cells and up-regulation of miR- 489 expression inhibits stem cell phenotype and epithelial-mesenchymal transition through targeting TWIST1 in colon cancer.

miR- 489; TWIST1; colon cancer; cancer stem cells; epithelial-mesenchymal transition

2017- 03- 14

2017- 04- 28

陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目(2014SF2- 16)

*通信作者(correspondingauthor)：renli37465@163.com

1001-6325(2018)01-0051-06

R735.3

A