RP-HPLC法同時測定不同產(chǎn)地女貞子中8個主要成分的含量

易 駿 ，吳建國 ，黃運喜 ，吳巖斌 （.福建教育學院理科部，福建 福州 35005；.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建 福州 350）

RP-HPLC法同時測定不同產(chǎn)地女貞子中8個主要成分的含量

易 駿1，吳建國2，黃運喜2，吳巖斌2（1.福建教育學院理科部，福建 福州 350025；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建 福州 350122）

目的 建立同時測定不同產(chǎn)地女貞子中羥基酪醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素、芹菜素8種化學成分的HPLC方法。 方法 采用YMC-Pack ODS-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL／min，檢測波長為265 nm，柱溫為25℃。 結果 在上述色譜條件下，羥基酪醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素、 芹菜素獲良好分離， 分別在 21.3～852、22.6～723.2、21.3～852、25～1000、22.8～273.8、23.9～1074、0.945～9.45和 2.3～27.4 μg／mL 內(nèi)線性關系良好， 平均回收率分別為 101.43%、100.91%、101.90%、98.86%、99.07%、98.86%、99.17%、102.25%。 結論 該方法簡便，重復性好，可以更好地用于女貞子藥材的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；女貞子；特女貞苷；女貞苷G13；含量測定

女貞子為木犀科女貞屬植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實，主要分布在我國長江流域及南方各地，資源豐富，為國家頒布的保健食品目錄中的物品之一，常為藥食兩用，具有滋補肝腎、烏須明目之功效［1］，作為中藥應用已有2 000多年歷史。女貞子始載《神農(nóng)本草經(jīng)》，是中醫(yī)常用扶正固本藥物，民間用其泡酒以補益肝腎，抗衰祛斑；與桑葚配伍制得桑椹二至膏用于肝腎不足，須發(fā)早白；另外，女貞子可作為茶用，如二子菊花飲、二綠女貞茶等，可起到很好的保健效果［2］。環(huán)烯醚萜類為女貞子主要活性成分，如特女貞子苷為2015年版《中國藥典》定量的品質(zhì)評價指標成分［1］。但女貞子藥效并不是靠個別成分含量決定［3］，女貞子其他活性成分，如苯乙醇類（紅景天苷、羥基酪醇和類葉生麻苷）、黃酮類（槲皮素和芹菜素）、環(huán)烯醚萜（特女貞苷、橄欖苦苷和女貞苷G13）等因具有抗氧化、抗骨質(zhì)疏松等活性［3，4］，也逐一被用于女貞子的品質(zhì)評價［5，6］，但仍然不夠完整，通過分析與藥效相關的化合物群的含量才能真實反映藥材的質(zhì)量［6］。因此有必要建立女貞子苯乙醇類、黃酮類和環(huán)烯醚萜類等多種活性成分群的品質(zhì)評價方法，用于評價女貞子品質(zhì)，為規(guī)范女貞子生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-20AT系列高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV檢測器（日本島津公司）；MS105DU電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DFT-200手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 試藥 女貞子采自福建、江西、云南、浙江、江蘇、貴州、山西、河北、河南、湖北、安徽和山東12個省份，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院吳錦忠教授鑒定為木犀科植物女貞的干燥成熟果實，不同產(chǎn)地女貞子的編號、采集樣品地點和時間見表1；羥基酪醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素、芹菜素為本實驗室從女貞子中分離獲得，純度大于98%；色譜乙腈（美國Fisher公司）；甲醇為分析純；Milli-Q超純水機（法國 Millipore公司）。

表1 女貞子藥材來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件 YMC-Pack ODS-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相組成為 A （乙腈）-B（0.2%甲酸水溶液）；梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：265 nm；柱溫：25℃；進樣量 20 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取羥基酪

醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素、芹菜素對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成對照品儲備液，備用。

2.3 供試樣品溶液的制備 取女貞子藥材粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%乙醇 50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取2 h，過濾，濾液 50℃減壓濃縮，用80%甲醇定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得?；旌蠈φ掌芳肮┰嚻飞V圖見圖 1。

圖1 混合對照品及供試品HPLC色譜圖

2.4 標準曲線及線性范圍 分別精密移取上述混合對照品溶液，加80%甲醇稀釋，稀釋成不同倍數(shù)，得一系列對照品混合溶液，搖勻。在上述色譜條件下進樣分析，以各成分峰面積為縱坐標（y），質(zhì)量濃度（μg／mL）為橫坐標（x），繪制標準曲線，計算回歸方程和線性范圍。見表3。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.3”項下制備的女貞子供試品溶液（編號6），按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)重復進樣6次，記錄峰面積。計算結果顯示：羥基酪醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素、芹菜素峰面積的 RSD值分別為 0.99%、0.36%、0.79%、0.18%、0.17%、0.20%、0.25%、0.54%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批女貞子樣品（編號6），精密稱取 6份，按“2.3”項下處理，按“2.1”項色譜條件測定，記錄峰面積。計算結果顯示：羥基酪醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD值分別為2.69%、1.36%、2.13%、1.556%、2.00%、2.06%、1.37%和1.79%，表明該方法重復性良好。

表3 混合對照品回歸方程和線性范圍

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批女貞子樣品（編號6），按“2.3”項下處理，按“2.1”項色譜條件，分別于 0、4、8、16、24、48 h 測定，記錄峰面積。計算結果顯示：羥基酪醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素、芹菜素峰面積的 RSD值分別為 1.21%、1.47%、2.04%、1.17%、0.97%、2.21%、1.28%、0.97%，表明供試品溶液在 48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗 取已知含有量的樣品（編號6），精密稱取6份，分別精密加入一定量對照品，按“2.3”項下方法，制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率?；厥章式Y果顯示，羥基酪醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素、芹菜素的平均回收率分別為 101.43%、100.91%、101.90%、98.86%、99.07%、98.86%、99.17%、102.25%，RSD 分別為 2.54%、1.93%、2.47%、1.49%、2.38%、1.06%、2.84%、2.29%，表明 8個化合物的加樣回收率良好。

2.9 樣品含量的測定 取不同產(chǎn)地的女貞子藥材各1 g，精密稱取，以“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣 20 μL，按“2.1”項色譜條件下分析測定，每批樣品測定3份，以平均值為測定結果，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（n＝3）mg／g

3 討 論

研究表明：女貞子不同采收期特女貞子苷、木犀草素和芹菜素等含量差異較大［2，7］。由于女貞子為女貞干燥成熟果實，我國長江流域及南方各地大多在秋末冬初，女貞子果實才成熟，所以采集時間為同年11-12月份，能更為客觀地評價不同產(chǎn)地女貞子品質(zhì)。

2015年版《中國藥典》規(guī)定特女貞苷的限量不低于0.70%，在所測16批不同產(chǎn)地的女貞子藥材中，有5個產(chǎn)地（湖北恩施、河北保定、浙江臺州、安徽合肥和江蘇南京）的女貞子藥材中特女貞苷的含量低于《中國藥典》2015年版含量限度，占31.25%。山西運城和福建福州女貞子藥材中女貞苷G13的含量較高，分別為 23.687 mg／g 和 37.001 mg／g，其原因有待進一步研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：從女貞子中分離的羥基酪醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素和芹菜素均有不同程度的抗氧化和抗骨質(zhì)疏松活性［4］，因此建議采用多種活性成分群評價女貞子品質(zhì)，可較為客觀地反映女貞子內(nèi)在質(zhì)量。

試驗考察了甲醇-水和乙腈-水兩個溶劑系統(tǒng)，結果顯示乙腈-水系統(tǒng)的分離效果更好。女貞子中含有部分弱酸性的酚類化合物，故分別考察了甲酸、乙酸、磷酸水溶液-乙腈系統(tǒng)，結果顯示乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，可有效地分離羥基酪醇、紅景天苷、類葉生麻苷、特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷G13、木犀草素、芹菜素。

本方法重現(xiàn)性較好，方法相對簡單和準確，可用于女貞子藥材內(nèi)在質(zhì)量評價，為女貞子質(zhì)量標準控制和規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。

［1］ 國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：46.

［2］ 戴一，賈曉益，汪會.不同采收期女貞子中木犀草素和芹菜素動態(tài)變化研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2015，26（2）：461-463.

［3］ 李昌勤，姚辰，朱榮遙，等．基于HPPH、ABTS和FRAP的中藥女貞子抗氧化譜效關系研究［J］.中國中藥雜志，2016，41（9）：1670-1677.

［4］ HUANG Y X，WU Y B，WU J G，et al.Chemical constituents from ligustrum lucidum differentially promote bone formation and prevent oxidative damage in osteoblastic UMR-106 cells［J］.Lat Am J Pharm，2014，33（2）：258-65.

［5］ 周逸芝，鄒立思，劉毅，等．膠束毛細管電泳測定女貞子飲片中 6 種指標成分的含量［J］.中國藥學雜志，2014，49（11）：994-998.

［6］ 趙麗敏，盧廣英，楊書娟，等．基于酚類成分特征圖譜的女貞子質(zhì)量表征研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2016，39（6）：480-488.

［7］ 田志祥，王偉，劉藝，等．不同生長月份女貞子中特女貞苷含量的動態(tài)差異［J］.西部中醫(yī)藥，2016，29（3）：37-40.

R284.1

A

1000-338X（2017）06-0032-03

2017-08-25

福建省科技廳引導性項目（2015Y0070）、（2014Y0049）

易駿（1966—），女，副教授，主要從事藥用植物資源化學及品質(zhì)評價研究。

吳巖斌（1982—），男，助理研究員。E-mail：wxsq1@163.com