玉米籽粒酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及ZmSCL1互作因子篩選

趙倩倩 周曉今 陳茹梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

玉米籽粒酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及ZmSCL1互作因子篩選

趙倩倩 周曉今 陳茹梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

ZmSCL1屬于GRAS家族基因，在玉米籽粒，尤其是胚乳中高表達(dá)，而這個(gè)時(shí)期是玉米灌漿的關(guān)鍵時(shí)期，鑒于ZmSCL1的分子功能以及其與玉米籽粒發(fā)育的關(guān)系尚不明確。利用SMART同源重組交換技術(shù)，在酵母菌株AH109中構(gòu)建了玉米自交系B73授粉后不同時(shí)期籽粒的cDNA文庫(kù)，利用此文庫(kù)篩選了ZmSCL1的互作因子。文庫(kù)質(zhì)量評(píng)定結(jié)果顯示：cDNA文庫(kù)的滴度為1.10×105CFU/mL，文庫(kù)的庫(kù)容量為1.32×106，文庫(kù)的重組率為81.90%，插入片段所編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度在133-500個(gè)氨基酸之間。最終，獲得了190個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)這些克隆進(jìn)行測(cè)序，利用GO注釋對(duì)所篩選的互作因子進(jìn)行初步分類，并進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果顯示ZmSCL1可能參與結(jié)合、催化以及營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備相關(guān)生物過(guò)程的調(diào)控。

GRAS家族基因；SMART技術(shù)；cDNA文庫(kù)；ZmSCL1基因

玉米是重要的糧飼兼用作物，我國(guó)玉米年均種植面積超約3.3×107hm2，產(chǎn)量超2×108t，是世界第二大玉米生產(chǎn)國(guó)。玉米籽粒在授粉后開(kāi)始發(fā)育，葉片中光合作用產(chǎn)生的淀粉、蛋白質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)儲(chǔ)存在籽粒里的生物學(xué)過(guò)程，稱為灌漿期。在這一階段，源、庫(kù)關(guān)系調(diào)控植株光合作用產(chǎn)生的碳水化合物從營(yíng)養(yǎng)器官向籽粒轉(zhuǎn)移，葉片光合產(chǎn)物的90%運(yùn)往籽粒，通過(guò)一系列蛋白間的相互作用進(jìn)而調(diào)控一系列酶催化，將蔗糖轉(zhuǎn)化為淀粉。因此，灌漿對(duì)于決定玉米籽粒發(fā)育的成敗和產(chǎn)量至關(guān)重要［1-2］。

玉米籽粒灌漿速率的研究一直是玉米育種領(lǐng)域的重要科學(xué)問(wèn)題，延長(zhǎng)籽粒灌漿持續(xù)時(shí)間和加快灌漿速率有利于籽粒中干物質(zhì)的積累，從而提高籽粒產(chǎn)量［3-6］。提高灌漿速率既可以使玉米利用生長(zhǎng)期的有效積溫和水肥營(yíng)養(yǎng)獲得經(jīng)濟(jì)的籽粒產(chǎn)量［7］，也可以使籽粒含水量迅速降低避免秋季霜凍帶來(lái)的危害。研究發(fā)現(xiàn)植物的糖通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)體和輸出載體從母體組織持續(xù)的運(yùn)出和運(yùn)入過(guò)程中，任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生變化都會(huì)影響蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用［8-10］；并且糖和淀粉代謝酶的活躍程度及相關(guān)基因的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)直接影響籽粒庫(kù)器官的活力，進(jìn)而影響籽粒灌漿速率［11-14］。

研究參與和調(diào)控籽粒灌漿期生化過(guò)程的關(guān)鍵基因和調(diào)控因子，解析調(diào)控籽粒灌漿速率的分子機(jī)制，一方面有助于我們了解這一生物學(xué)過(guò)程的重要信息；另一方面可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中培育適應(yīng)機(jī)械化收獲的快速灌漿和快速脫水的玉米品種提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)B73玉米基因組信息和生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了在玉米灌漿期籽粒中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子GRAS家族基因，ZmSCL1是其中之一。該基因在玉米籽粒中，尤其是胚乳中高表達(dá)，進(jìn)化樹(shù)分析表明其和DELLA亞家族的成員的序列同源性最高［15］。鑒于蛋白質(zhì)是基因功能的體現(xiàn)者和執(zhí)行者，其表達(dá)的時(shí)空特異性，及與上下游互作因子的關(guān)聯(lián)性是決定其在生命過(guò)程中發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。為深入研究了解ZmSCL1在灌漿過(guò)程中的功能，本研究在分析其基因序列和轉(zhuǎn)錄水平信息的基礎(chǔ)上，采用SMART cDNA合成技術(shù)，通過(guò)同源重組方法構(gòu)建了玉米籽粒灌漿期的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，并利用ZmSCL1作為誘餌進(jìn)行文庫(kù)篩選，以期獲得在玉米籽粒灌漿期與ZmSCL1互作的蛋白，為闡明ZmSCL1及其互作相關(guān)因子調(diào)控籽粒灌漿的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米自交系B73由本實(shí)驗(yàn)室保存，B73種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊基地，取材授粉后12 d、20 d的籽粒材料；pGADT7和pGBKT7空載質(zhì)粒由本實(shí)

驗(yàn)室保存；RNA提取試劑RNAiso Plus購(gòu)自TaKaRa公司；Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System User Manual購(gòu)自 Clontech公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；酵母菌株AH109，載體pGADT7-Rec購(gòu)自Clontech公司；YPD Agar Medium購(gòu)自生工生物；Yeast Nitrogen Base W/O Amino Acids購(gòu)自BD公司；SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp購(gòu)自Clontech公司；BactoTMAgar購(gòu)自BD公司；瓊脂糖購(gòu)自Amresco公司；引物合成及測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 用液氮研磨不同授粉時(shí)間12 DAP（Days after pollination）和20 DAP的籽粒，采用RNAiso Plus（TaKaRa公司）提取籽?？俁NA，每1 mL RNAiso Plus試劑提取30 mg樣品；最終將RNA溶解到30 μL 無(wú)RNase的水中。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量。

1.2.2 誘餌載體的構(gòu)建 將12 DAP和20 DAP的總RNA分別逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，依據(jù)MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)中ZmSCL1基因的序列信息設(shè)計(jì)引物ZmSCL1-BDF/R（ZmSCL1-BDF：5'-CATATGATGGATGCTCACACCAC TCACATTG-3'；ZmSCL1-BDR：5'-GGATCCCTACTCC ATGGGTCCATTACGGTTTTC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣基因的兩端分別帶有BamH I和Xba I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物切膠回收，使用BamH I和Xba I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，與經(jīng)相同方式酶切的pGBKT7空載的酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（DH5α），經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析，獲得pGBKT7-ZmSCL1構(gòu)建。

1.2.3 AH109菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備 用YPDA培養(yǎng)基活化和培養(yǎng)酵母AH109菌株，使用美國(guó)伯樂(lè)公司的分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度OD600。在YPDA培養(yǎng)基中搖菌，至OD600達(dá)到0.15-0.3，700 ×g離心5 min，棄上清，加入新鮮的100 mL YPDA培養(yǎng)基重懸菌液并繼續(xù)培養(yǎng)，至OD600達(dá)到0.4-0.5，700×g離心收集菌體，并用滅菌水重懸菌體，離心收集，用1.1×TE/LiAc溶液重懸菌體，再次離心收集菌體，最后，制備好的感受態(tài)細(xì)胞重懸在1.1×TE/LiAc溶液中。

1.2.4 誘餌融合蛋白的自激活活性鑒定 按照Clontech YeastmakerTMYeast Transformation System 2說(shuō)明書(shū)中的轉(zhuǎn)化方法，參照趙慧等［16］的轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)方法，將構(gòu)建好的誘餌載體質(zhì)粒pGBKT7-ZmSCL1 0.2 μg 和空載質(zhì)粒 pGADT7 0.1 μg共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)將空載對(duì)照pGADT7+pGBKT7、陽(yáng)性對(duì)照pGADT7+pGBKT7-53均按以上質(zhì)量比進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。最后將轉(zhuǎn)化菌體吸取150 μL涂布SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板，30℃溫箱中倒置培養(yǎng)3-5 d觀察結(jié)果。

1.2.5 雙鏈cDNA的合成 以0.1-2.0 μg總RNA為模版，以CDS Ⅲ（Oligo-dT）為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；以第一鏈cDNA為模版，使用Long distance PCR（LD PCR）擴(kuò)增合成ds cDNA（擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 10 s，68℃ 6 min，20個(gè)循環(huán)；68℃ 5 min）；在1.2%的瓊脂糖凝膠上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析（參照Make Your Own “Mate & PlateTM”Library System User Manual使用說(shuō)明書(shū)）。

1.2.6 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 使用制備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞，參照崔紅軍等［17］的文庫(kù)構(gòu)建方法和楊莎等［18］的酵母共轉(zhuǎn)化篩選方法，在 600 μL 感受態(tài)細(xì)胞中加入 20 μL ds cDNA（5 μg），6 μL pGADT7-Rec（3 μg）質(zhì)粒載體，5 μL pGBKT7-ZmSCL1（5 μg），20 μL Herring Tests Carrier DNA，輕柔混勻。加入2.5 mL PEG/LiAc溶液，輕柔混勻。30℃孵育45 min且每15 min混勻一次，然后加入160 μL DMSO（用DMSO增強(qiáng)細(xì)胞通透性），42℃孵育20 min，且中間每10 min混勻一次，即采用熱激法將誘餌、質(zhì)粒載體和ds cDNA導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，然后700×g離心5 min收集菌體，棄上清，加入3 mL YPD Plus（試劑盒提供）30℃搖床培養(yǎng)90 min，再離心收集菌體，最后用6 mL 0.9% NaCl溶液重懸菌體。轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞液，吸取10 μL，按比例1∶100，1∶1 000稀釋，分別涂SD/-Leu平板各兩個(gè)，500 μL/板；吸取 100 μL，按比例 1∶10，1∶100，1∶1 000稀釋，分別涂SD/-Leu/-Trp平板各兩個(gè)，500 μL/板；將剩下的細(xì)胞液涂SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp，500 μL/板。30℃倒置培養(yǎng) 3-5 d。詳見(jiàn) Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System User Manual使用說(shuō)明書(shū)VⅢ-A。

1.2.7 文庫(kù)滴度、重組率和多態(tài)性分析 待上述涂SD/-Leu平板（按比例1∶100，1∶1 000稀釋）上長(zhǎng)出單克隆后，統(tǒng)計(jì)平板上的菌落計(jì)數(shù)，參照楊君等［19］的文庫(kù)滴度計(jì)算方法，計(jì)算文庫(kù)滴度（文庫(kù)滴度（CFU/mL）=每板平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)）。挑SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上的單克隆搖菌培養(yǎng)，2-3 d，使用天根酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取酵母質(zhì)粒DNA，使用pGADT7-Rec載體引物（pGADT7-F：5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'和pGADT7-R：5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3'）進(jìn)行菌落PCR，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算文庫(kù)重組率（%）=陽(yáng)性克隆數(shù)/檢測(cè)菌落數(shù)×100%，并分析文庫(kù)多態(tài)性。詳見(jiàn)Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System User Manual使用說(shuō)明書(shū)。

1.2.8 ZmSCL1互作因子的篩選和生物信息學(xué)分析 參照酵母建庫(kù)試劑盒，構(gòu)建ZmSCL1誘餌載體，并在上述的cDNA文庫(kù)中篩選ZmSCL1的互作因子。所篩選的克隆進(jìn)行測(cè)序，除去載體序列，測(cè)序長(zhǎng)度大于400 bp的DNA片段通過(guò)Blast2GO和玉米轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行同源比對(duì)，獲得基因的全長(zhǎng)，對(duì)這些基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和富集分析。Blast2GO的參數(shù)按照軟件說(shuō)明設(shè)置。

2 結(jié)果

2.1 玉米中ZmSCL1的表達(dá)特性

基因的時(shí)空表達(dá)特異性與其參與的功能直接相關(guān)。根據(jù)B73玉米基因組信息和生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了在玉米灌漿期籽粒中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子GRAS家族基因，最終獲得了在胚乳中特異性表達(dá)的ZmSCL1。ZmSCL1從授粉后12-24 d持續(xù)高表達(dá)（圖1）。這說(shuō)明ZmSCL1可能參與玉米籽粒，尤其是胚乳的發(fā)育調(diào)控。

2.2 玉米籽?？俁NA的提取

以玉米籽粒灌漿期ZmSCL1表達(dá)量較高的12 DAP和20 DAP籽粒為材料，使用Takara公司的RNAiso Plus試劑，提取籽?？俁NA，使用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取的總RNA質(zhì)量，如圖2所示，28S和18S rRNA條帶清晰，表明RNA完整性較好；經(jīng)Nano drop測(cè)定分析，A260/A280在1.9-2.1之間，濃度約為1-2 μg/μL，這表明RNA無(wú)DNA、蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)的污染，濃度較高，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 B73中ZmSCL1的表達(dá)譜

圖2 玉米籽粒總RNA電泳檢測(cè)

2.3 誘餌融合蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性鑒定

將實(shí)驗(yàn)組pGADT7+pGBKT7-ZmSCL1共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空載對(duì)照組pGADT7+pGBKT7、陽(yáng)性對(duì)照組pGADT7+pGBKT7-53。結(jié)果（圖3）顯示，實(shí)驗(yàn)組在SD/-Leu/-Trp平板上有菌落生長(zhǎng)，但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，與空載對(duì)照相同。這說(shuō)明該誘餌基因的融合蛋白沒(méi)有自激活活性，可以進(jìn)行下一步酵母雙雜交互作蛋白的篩選。

2.4 ds cDNA的合成

以2 μL RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，然后經(jīng)20次LD-PCR合成雙鏈cDNA（ds cDNA），合成的ds cDNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖4所示，12 DAP和20 DAP的ds cDNA呈彌散狀，大小集中分布在600-1 500 bp范圍內(nèi)。

2.5 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選

依據(jù)SMART同源重組原理，將12 DAP和20 DAP的ds cDNA使用Nano drop進(jìn)行定量，然后等量混合。將混合好的ds cDNA、pGADT7-Rec載體和誘餌pGBKT7-ZmSCL1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞，涂布SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板進(jìn)行篩選，3-5 d后長(zhǎng)出單克隆。統(tǒng)計(jì)SD/-Leu上稀釋100倍和1 000倍后長(zhǎng)出的單克隆數(shù)目（圖5），求平均值后計(jì)算文庫(kù)滴度，文庫(kù)滴度=每板平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)=1.10×105CFU/mL，文庫(kù)庫(kù)容量為1.32×106。SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上共計(jì)232個(gè)單克隆，搖菌提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分結(jié)果如圖6所示，顯示插入片段的大小集中在400-1 500 bp之間，陽(yáng)性菌落數(shù)為190個(gè)，重組率為81.90%。

圖3 誘餌融合蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性鑒定

圖4 ds cDNA電泳檢測(cè)cDNA片段大小范圍

圖5 文庫(kù)滴度測(cè)定

圖6 PCR檢測(cè)文庫(kù)插入片段瓊脂糖膠檢測(cè)

2.6 候選因子的GO分析

將插入的cDNA進(jìn)行測(cè)序，除去載體序列，測(cè)序長(zhǎng)度大于400 bp為有效克隆。將有效測(cè)序結(jié)果的序列用Blast2GO進(jìn)行同源比對(duì)，最終獲得164個(gè)基因的全長(zhǎng)（表1）。GO功能富集分析對(duì)這些互作蛋白進(jìn)行了初步分類（圖7）：生物過(guò)程（Biological Process）注釋顯示，參與細(xì)胞生理過(guò)程和代謝過(guò)程分別有79和73個(gè)肽段，即候選蛋白注釋信息主要富集于參與細(xì)胞生理過(guò)程和代謝過(guò)程；分子功能（Molecular Function）注釋顯示，結(jié)合、催化和營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備的分別有61、57和56個(gè)肽段，即候選蛋白注釋信息主要富集于結(jié)合、催化和營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備相關(guān)功能。因此，本結(jié)果顯示ZmSCL1可能參與結(jié)合、催化和營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備相關(guān)生命活動(dòng)。

3 討論

cDNA文庫(kù)的完整性和代表性是評(píng)價(jià)cDNA文庫(kù)質(zhì)量的重要指標(biāo)?？俁NA樣本的完整性和高純度是構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫(kù)的前提，并直接決定cDNA文庫(kù)的好壞。本實(shí)驗(yàn)中的12 DAP和20 DAP樣本總RNA條帶清晰，未發(fā)生降解，并且沒(méi)有多聚糖、蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)的污染，因而具備了構(gòu)建高質(zhì)量籽粒cDNA文庫(kù)的前提條件。

本研究利用SMART（Switching Mechanism at 5’End of the RNA Transcript）技術(shù)合成ds cDNA，不需要對(duì)樣本總RNA中mRNA進(jìn)行分離純化，避免了純化過(guò)程中產(chǎn)生的mRNA降解；合成的cDNA片段集中在600-1 500 bp之間，具有較好的多態(tài)性，適合進(jìn)行下一步酵母雙雜交篩選互作蛋白；利用了同源重組的方法，把外源ds cDNA定向重組到pGADT7-Rec載體上，有效的避免了繁瑣的酶切連接等步驟，也解決了低效率的連接和克隆的嵌合問(wèn)題，從而保證了cDNA文庫(kù)整合外源ds cDNA時(shí)的方向性和完整性［20］。

本研究采用將ds cDNA和誘餌質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞的方法［18］，直接獲得了籽粒灌漿期與ZmSCL1互作的候選蛋白，當(dāng)實(shí)驗(yàn)不需要進(jìn)行多次篩選文庫(kù)時(shí)，該方法不產(chǎn)生凍存的文庫(kù)，可作為一個(gè)非?？焖俚幕プ鞯鞍缀Y選過(guò)程。

本研究以玉米籽粒灌漿期12 DAP和20 DAP的籽粒為材料構(gòu)建cDNA文庫(kù)，使用玉米胚乳特異高表達(dá)基因ZmSCL1作為誘餌基因，進(jìn)行互作蛋白篩選，初步篩選到了一些在籽粒灌漿期可能與ZmSCL1互作的候選蛋白，GO功能富集分析顯示候選蛋白注釋信息主要富集于結(jié)合、催化和營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備相關(guān)功能，而淀粉的合成和營(yíng)養(yǎng)積累是玉米籽粒灌漿期胚乳的主要生命活動(dòng)［21］。值得注意的是，酵母雙雜交的結(jié)果顯示，候選蛋白中也篩選到了蔗糖合酶1

（Sucrose synthase 1，SUS1）和UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase 76E12，UGT76E12）。因此，ZmSCL1可能參與結(jié)合、催化和營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備相關(guān)的生命活動(dòng)。接下來(lái)的互作驗(yàn)證以及ZmSCL1功能驗(yàn)證的開(kāi)展將為解析玉米籽粒灌漿期的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和闡明玉米灌漿期的分子機(jī)制奠定必備的研究基礎(chǔ)。

表1 酵母雙雜交陽(yáng)性克隆基因比對(duì)結(jié)果

續(xù)表

續(xù)表

圖7 候選互作蛋白的GO分析

4 結(jié)論

本研究使用玉米胚乳特異高表達(dá)基因ZmSCL1作為誘餌，在構(gòu)建的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)中初步篩選到了玉米籽粒灌漿期可能與ZmSCL1互作的蛋白。文庫(kù)滴度為1.10×105CFU/mL，文庫(kù)庫(kù)容量為1.32×106，插入片段大小集中在400-1 500 bp之間，重組率為81.9%。GO分類結(jié)果顯示ZmSCL1可能參與結(jié)合、催化和營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備相關(guān)生物過(guò)程的調(diào)控。

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Screening Interacted Factors of ZmSCL1 in Yeast Two-hybrid cDNA Libraries of Developing Maize Seeds

ZHAO Qian-qian ZHOU Xiao-jin CHEN Ru-mei
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

ZmSCL1 is a member of GRAS gene family. Although highly expressed in maize seeds in the key period for the filling period of maize，especially in the endosperm，the molecular function of ZmSCL1 for maize seeds development remains unclear. Therefore，to screen interaction factors for ZmSCL1，yeast two-hybrid cDNA libraries of maize inbred line（B73）developing seeds（12 and 20 days after pollination）were constructed in yeast strain AH109 using homologous recombination-mediated SMART technology. The qualities of the cDNA libraries were evaluated as the followings：the titers were 1.10×105CFU/mL，the capacity of cDNA library was 1.32×106，the recombinant rate was 81.90%，and the protein length encoded by the inserted cDNA ranged from 133 aa to 500 aa. Finally，109 clones were obtained for sequencing. GO enrichment analysis showed that，ZmSCL1 may be involved in the regulation of starch and nutrition accumulation.

GRAS gene family；SMART technology；cDNA library；ZmSCL1 gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0408

2017-05-30

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973”項(xiàng)目（2014CB138200）

趙倩倩，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：zhaoqianqian@yeah.net

陳茹梅，女，研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：chenrumei@caas.cn

（責(zé)任編輯 朱琳峰）